目前SARS-CoV-2臨床試驗用脂質納米顆粒的開發

mRNA最早的轉染試(shi)劑(ji)是(shi)季(ji)銨(an)化(hua)陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)(zi)DOTAP結(jie)合(he)(he)(he)可(ke)電(dian)離(li)(li)和(he)(he)(he)融合(he)(he)(he)的DOPE，采用(yong)DNA轉染[85]，用(yong)于在(zai)眾多細胞(bao)(bao)類型(xing)中轉染mRNA[86]。盡管在(zai)體(ti)(ti)外有(you)效，但(dan)永久性(xing)陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)(zi)季(ji)銨(an)基團(tuan)使這些大(da)尺(chi)寸的脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)復合(he)(he)(he)物從(cong)循環和(he)(he)(he)其通常靶器(qi)官肺中迅速(su)清除，并(bing)表現出毒性(xing)。今天LNP的先驅是(shi)穩(wen)(wen)(wen)定(ding)的質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)-脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)顆粒(li)(li)(li)(SPLP)，它是(shi)由(you)融合(he)(he)(he)基因電(dian)離(li)(li)的DOPE與(yu)季(ji)銨(an)化(hua)的陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)DODAC結(jie)合(he)(he)(he)形(xing)成(cheng)的，DODAC靜電(dian)結(jie)合(he)(he)(he)并(bing)包(bao)裹質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)DNA，然后用(yong)親水(shui)性(xing)PEG包(bao)被，使其在(zai)水(shui)介(jie)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)中穩(wen)(wen)(wen)定(ding)，并(bing)在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)(nei)給(gei)藥(yao)時限制(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)細胞(bao)(bao)相互(hu)作用(yong)[87]。DOPE在(zai)細胞(bao)(bao)攝取后可(ke)在(zai)內(nei)(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)中質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)子(zi)(zi)化(hua)，由(you)于呈錐(zhui)形(xing)，因此可(ke)與(yu)內(nei)(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)形(xing)成(cheng)內(nei)(nei)(nei)體(ti)(ti)溶解離(li)(li)子(zi)(zi)對，以促進(jin)內(nei)(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)釋(shi)放，這是(shi)成(cheng)功遞送(song)的關鍵(jian)事(shi)件[17]。然后進(jin)一(yi)步將(jiang)SPLP開發(fa)為含有(you)siRNA的穩(wen)(wen)(wen)定(ding)核(he)酸脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)顆粒(li)(li)(li)(SNALP)，包(bao)括四種(zhong)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)：離(li)(li)子(zi)(zi)化(hua)而(er)不是(shi)季(ji)銨(an)化(hua)陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)、飽和(he)(he)(he)雙(shuang)層形(xing)成(cheng)季(ji)銨(an)化(hua)兩性(xing)離(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)、DSPC、膽(dan)固醇和(he)(he)(he)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)[88]。除了與(yu)核(he)酸靜電(dian)結(jie)合(he)(he)(he)外，SNALPs中的可(ke)電(dian)離(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)發(fa)揮了融合(he)(he)(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的作用(yong)，并(bing)在(zai)內(nei)(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)中質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)子(zi)(zi)化(hua)，與(yu)內(nei)(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)形(xing)成(cheng)膜不穩(wen)(wen)(wen)定(ding)離(li)(li)子(zi)(zi)對。目前已知(zhi)DSPC有(you)助于在(zai)PEG表面下形(xing)成(cheng)穩(wen)(wen)(wen)定(ding)的雙(shuang)層[89]。膽(dan)固醇發(fa)揮多種(zhong)作用(yong)，包(bao)括填(tian)補顆粒(li)(li)(li)間隙、限制(zhi)LNP–蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)相互(hu)作用(yong)和(he)(he)(he)可(ke)能促進(jin)膜融合(he)(he)(he)[90]。可(ke)電(dian)離(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)生(sheng)理pH下呈中性(xing)，從(cong)而(er)消除循環中的任何(he)陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)(zi)電(dian)荷，但(dan)在(zai)pH~6.5的內(nei)(nei)(nei)體(ti)(ti)中質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)子(zi)(zi)化(hua)，促進(jin)內(nei)(nei)(nei)體(ti)(ti)釋(shi)放，發(fa)揮核(he)心作用(yong)。

2018年臨床(chuang)批準(zhun)的(de)(de)(de)(de)(de)首個(ge)(ge)siRNA產品的(de)(de)(de)(de)(de)開(kai)(kai)發主要集中(zhong)在(zai)(zai)優化可(ke)電(dian)離脂(zhi)質，其(qi)次是PEG脂(zhi)質和LNP中(zhong)使(shi)用的(de)(de)(de)(de)(de)四(si)種(zhong)(zhong)脂(zhi)質的(de)(de)(de)(de)(de)比例，以及LNP組裝和生產程序。根(gen)據分子(zi)形狀假設(she)[12,91]，發現(xian)C18尾(wei)中(zhong)不飽和鍵(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)佳數(shu)量是通過(guo)醚連(lian)接到二甲胺頭基(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)二亞(ya)油酸尾(wei)[88]。然而，在(zai)(zai)亞(ya)油酸尾(wei)部引入單個(ge)(ge)連(lian)接體，其(qi)具有從二甲胺頭基(ji)到連(lian)接體的(de)(de)(de)(de)(de)優化碳數(shu)，導致LNP中(zhong)可(ke)電(dian)離脂(zhi)質DLin-MC3-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)pKa接近6.4[92,93]。優化的(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)后一步是將(jiang)MC3/DSPC/膽固醇/PEG–脂(zhi)質的(de)(de)(de)(de)(de)這(zhe)些脂(zhi)質摩(mo)爾比調節至50/10/38.5/1.5。總(zong)體從DLin-DMA到DLin-MC3-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)這(zhe)一優化過(guo)程需(xu)要在(zai)(zai)數(shu)千種(zhong)(zhong)制劑中(zhong)篩選(xuan)超過(guo)300種(zhong)(zhong)可(ke)電(dian)離的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質，并導致效價增加200倍和有效劑量相(xiang)應減少，以實現(xian)對靶基(ji)因(yin)> 80%的(de)(de)(de)(de)(de)持久抑制和允許治療窗，2018年Onpattro™獲得臨床(chuang)批準(zhun)[94,95]。這(zhe)種(zhong)(zhong)為siRNA開(kai)(kai)發的(de)(de)(de)(de)(de)MC3配方(fang)是隨后開(kai)(kai)發LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)礎，如下(xia)所述（圖1），在(zai)(zai)被批準(zhun)用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的(de)(de)(de)(de)(de)遞送后，LNPs現(xian)在(zai)(zai)正被緊急(ji)使(shi)用。

圖1 mRNA脂(zhi)質納米顆粒(li)結(jie)構。最近使(shi)用冷(leng)凍(dong)電子顯(xian)微鏡[96]、小(xiao)角中子散射和小(xiao)角X射線散(san)射[89]進行的研(yan)究表(biao)明，mRNA脂質納(na)米顆粒包括(kuo)低(di)拷貝數的mRNA(1-10)，并(bing)且mRNA與占(zhan)據LNP中心(xin)核心(xin)的可電離脂質結合。聚(ju)乙二(er)醇(PEG)脂質(zhi)(zhi)形(xing)成(cheng)脂質(zhi)(zhi)納米顆(ke)粒(LNP)的(de)表面，同時(shi)形成雙層的(de)DSPC。帶(dai)電(dian)荷(he)和不(bu)帶(dai)電(dian)荷(he)的膽固醇和可電(dian)離脂(zhi)質(zhi)可分布(bu)在整個LNP中。其他(ta)輸送系統(tong)的(de)結構(gou)示意圖(tu)在最近的(de)綜述中提供[14]。

Moderna使用上(shang)述Onpattro制劑中(zhong)的(de)MC3進行了幾項(xiang)臨(lin)(lin)床前[97,98,99]和臨(lin)(lin)床研究(jiu)[97,100]，以遞(di)送(song)核苷修(xiu)飾的(de)mRNA編碼免疫(yi)原(yuan)。在這些比較新的(de)一類(lei)可電離脂(zhi)質與MC3的(de)研究(jiu)中(zhong)，MC3后來被(bei)確定(ding)為(wei)可電離脂(zhi)質[42,101]。這個新類(lei)別包括Lipid H[42]，它是Moderna的(de)SARS-CoV-2產品mRNA-1273中(zhong)的(de)可電離脂(zhi)質SM-102[41]（表2）。

使用針對(dui)寨卡病毒的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)核苷修飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA編(bian)碼免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)，MC3 LNP能(neng)夠保(bao)護(hu)(hu)缺乏(fa)I型(xing)和II型(xing)干擾素(IFN)信號的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)功能(neng)低(di)下(xia)小鼠免(mian)受(shou)(shou)10µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)1次(ci)(ci)或2µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)初免(mian)-加(jia)強免(mian)疫(yi)(yi)設計的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)致死(si)(si)攻擊[99]。在(zai)(zai)預先給(gei)予(yu)抗ifnar1阻斷(duan)抗體以建(jian)立致死(si)(si)模(mo)(mo)型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)功能(neng)正(zheng)常小鼠中(zhong)(zhong)也獲得了(le)相似(si)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果。在(zai)(zai)一系(xi)列遞送(song)核苷修飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA編(bian)碼血凝素(HA)免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)流感研究(jiu)中(zhong)(zhong)，皮內遞送(song)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3 LNP能(neng)夠完全保(bao)護(hu)(hu)小鼠免(mian)受(shou)(shou)低(di)至0.4µg單次(ci)(ci)給(gei)藥(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)致死(si)(si)性(xing)(xing)攻擊，盡管即使單次(ci)(ci)給(gei)予(yu)高(gao)達10µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)，攻毒后也會(hui)出現體重減輕[97]。雪貂單次(ci)(ci)給(gei)予(yu)50µg或100µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)產生(sheng)了(le)較(jiao)高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HAI（血凝抑制試(shi)驗）滴(di)度(du)，非(fei)人靈(ling)長(chang)類動物單次(ci)(ci)給(gei)予(yu)200或400µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)也產生(sheng)了(le)較(jiao)高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HAI滴(di)度(du)。在(zai)(zai)接受(shou)(shou)100µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)少(shao)數(shu)(23)人類受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)中(zhong)(zhong)，在(zai)(zai)研究(jiu)開(kai)始時，所有(you)(you)(you)受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HAI滴(di)度(du)均(jun) > 40（who保(bao)護(hu)(hu)相關(guan)性(xing)(xing)），比基線高(gao)4倍以上。在(zai)(zai)一項更大規模(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)1期試(shi)驗中(zhong)(zhong)，使用相同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3 LNPs遞送(song)兩種(zhong)不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)核苷修飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA編(bian)碼的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HA免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)，肌肉注射(she)100µg的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)H10N8免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)導致23名受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)中(zhong)(zhong)100%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HAI滴(di)度(du) > 40[100]。盡管未發生(sheng)危及生(sheng)命的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)(bu)良(liang)(liang)事(shi)(shi)(shi)件，但這23例(li)受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)中(zhong)(zhong)有(you)(you)(you)3例(li)發生(sheng)了(le)重度(du)3級(ji)不(bu)(bu)良(liang)(liang)事(shi)(shi)(shi)件。3例(li)受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)2例(li)發生(sheng)3級(ji)不(bu)(bu)良(liang)(liang)事(shi)(shi)(shi)件（符合研究(jiu)暫停規則）后，停止(zhi)計劃(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)400µg給(gei)藥(yao)。在(zai)(zai)較(jiao)低(di)劑(ji)(ji)(ji)量(liang)下(xia)，不(bu)(bu)良(liang)(liang)事(shi)(shi)(shi)件的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)頻率(lv)和嚴(yan)重程度(du)降低(di)，但幾乎每例(li)受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)均(jun)發生(sheng)至少(shao)1起(qi)不(bu)(bu)良(liang)(liang)事(shi)(shi)(shi)件。這些研究(jiu)很有(you)(you)(you)前景，但也強調了(le)在(zai)(zai)不(bu)(bu)會(hui)引起(qi)問題數(shu)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)(bu)良(liang)(liang)事(shi)(shi)(shi)件的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)劑(ji)(ji)(ji)量(liang)下(xia)獲得保(bao)護(hu)(hu)性(xing)(xing)免(mian)疫(yi)(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)治療(liao)窗(chuang)相對(dui)較(jiao)窄。這讓人想起(qi)MC3前體DLin-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)治療(liao)窗(chuang)窄，需(xu)要提(ti)高(gao)效(xiao)力才能(neng)降低(di)劑(ji)(ji)(ji)量(liang)，仍(reng)然實(shi)現有(you)(you)(you)效(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基因敲低(di)。

表2脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)納米顆(ke)粒(li)中(zhong)(zhong)使用的可電離脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)。脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)納米顆(ke)粒(li)中(zhong)(zhong)使用的可電離脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)的一個關鍵特(te)征是，通過TNS染料結合試驗測定，LNP中可電離脂(zhi)質的pKa應在(zai)6-7范圍(wei)內。理(li)論上(shang)計算的大多數可電離基團(tuan)的pKa在(zai)8-9.5范圍內，如下(xia)所示在氮原(yuan)子上，使用商業軟件理論上估(gu)計(ji)水介質中的這些(xie)值。pKa從理論值下降2-3個(ge)點至TNS值是由于脂相中(zhong)質子的(de)溶劑化能量更高，導致(zhi)脂相中(zhong)的(de)pH值比水相高2-3個點(dian)，在TNS測定期間測量pH值[102]。

由于siRNA產(chan)品需要(yao)(yao)重復(fu)給(gei)藥(yao)(yao)治療(liao)慢性(xing)疾(ji)病，人(ren)們擔心MC3中(zhong)(zhong)二亞(ya)油(you)酸烷基(ji)尾(wei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)緩慢降(jiang)解(jie)(jie)會導(dao)致重復(fu)給(gei)藥(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蓄(xu)積和潛在(zai)(zai)毒性(xing)。MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)可(ke)降(jiang)解(jie)(jie)版本脂質(zhi)(zhi)(zhi)319（表(biao)2）是(shi)通(tong)過用(yong)(yong)在(zai)(zai)體(ti)內(nei)易(yi)于被(bei)酯(zhi)酶(mei)降(jiang)解(jie)(jie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)伯酯(zhi)取代每個(ge)烷基(ji)鏈中(zhong)(zhong)兩個(ge)雙鍵(jian)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)而產(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)[68]。觀(guan)察到脂質(zhi)(zhi)(zhi)319在(zai)(zai)肝(gan)臟中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)半衰期小于1小時(shi)，而其(qi)在(zai)(zai)肝(gan)臟中(zhong)(zhong)保持與MC3相似的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因沉默效率(lv)。在(zai)(zai)體(ti)內(nei)證實了(le)降(jiang)解(jie)(jie)產(chan)物(wu)，以及其(qi)分泌和脂質(zhi)(zhi)(zhi)319的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)無毒性(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)。在(zai)(zai)SARS-CoV-2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)臨床前(qian)和臨床研究(jiu)中(zhong)(zhong)引(yin)用(yong)(yong)了(le)脂質(zhi)(zhi)(zhi)319的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究(jiu)，作為BioNTech[49]和CureVac[53,69]產(chan)品中(zhong)(zhong)使用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)Acuitas LNP類別，盡(jin)管在(zai)(zai)倫敦帝國理工(gong)學院試驗[60]中(zhong)(zhong)Acuitas LNP遞送(song)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)自擴增RNA被(bei)引(yin)用(yong)(yong)為包含在(zai)(zai)最近(jin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)專利申請中(zhong)(zhong)[59]，這里由Acuitas的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)Lipid A9代表(biao)（表(biao)2）。最近(jin)，BioNTech批準的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)BNT162b2中(zhong)(zhong)Acuitas可(ke)電離(li)脂質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)同一(yi)(yi)性(xing)被(bei)披露為ALC-0315[40]（表(biao)2）。這些LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)重要(yao)(yao)方面是(shi)，它(ta)們是(shi)通(tong)過篩選IV給(gei)藥(yao)(yao)后肝(gan)臟中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA表(biao)達而開(kai)發的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，可(ke)能還(huan)沒有完全優(you)化用(yong)(yong)于基(ji)于mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)疫苗的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肌內(nei)給(gei)藥(yao)(yao)。

Moderna最(zui)近開(kai)發了一(yi)類(lei)新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)電離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)來替(ti)代MC3，主要(yao)是(shi)由(you)(you)于(yu)(yu)上(shang)述與(yu)(yu)(yu)(yu)MC3降(jiang)解(jie)(jie)緩(huan)慢相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)問題，但也努(nu)力(li)通(tong)(tong)過實現比(bi)二(er)亞油酸MC3烷基尾更大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分支來提高(gao)其效(xiao)(xiao)力(li)[42,101]。這(zhe)(zhe)類(lei)新(xin)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)具有(you)乙醇胺(an)可(ke)(ke)電離(li)頭基，與(yu)(yu)(yu)(yu)含有(you)一(yi)級降(jiang)解(jie)(jie)酯（如Maier 2013）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單個飽和尾連接(jie)，并與(yu)(yu)(yu)(yu)第二(er)個飽和尾連接(jie)，后者使(shi)用降(jiang)解(jie)(jie)性(xing)(xing)較低(di)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)級酯在(zai)7個碳原(yuan)(yuan)子后分支成兩個飽和C8尾，如脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)5[101]（表(biao)(biao)2）。優化用于(yu)(yu)肝臟IV給(gei)藥(yao)，發現相(xiang)似(si)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)H[42]或(huo)SM-102是(shi)疫苗(miao)肌內(IM)給(gei)藥(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)佳選擇。分支增(zeng)加(jia)是(shi)Acuitas追求(qiu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)共同特征，因為(wei)(wei)Lipid A9共有(you)5個分支鏈(lian)[59]（表(biao)(biao)2），而(er)(er)Moderna LNPs有(you)3個分支鏈(lian)。分支增(zeng)加(jia)被認(ren)為(wei)(wei)可(ke)(ke)產(chan)生具有(you)更多錐形結構的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)電離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)，因此(ci)，當(dang)與(yu)(yu)(yu)(yu)內體(ti)(ti)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)陰離(li)子磷脂(zhi)(zhi)(zhi)配對(dui)(dui)(dui)時(shi)，將(jiang)發生更大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜破(po)壞(huai)能(neng)(neng)力(li)，遵循幾十年前(qian)概述的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子形狀假設[12,91]。當(dang)IV給(gei)藥(yao)時(shi)，24h時(shi)在(zai)肝臟中(zhong)檢(jian)測不(bu)到脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)5，而(er)(er)MC3以其初始劑量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)71%存在(zai)于(yu)(yu)肝臟中(zhong)，驗(yan)證Lipid 5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)降(jiang)解(jie)(jie)性(xing)(xing)。IV給(gei)藥(yao)后，Lipid 5在(zai)小鼠中(zhong)熒光素(su)酶表(biao)(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效(xiao)(xiao)力(li)是(shi)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)3倍(bei)，在(zai)非人(ren)靈長(chang)類(lei)動物(wu)中(zhong)hEPO的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效(xiao)(xiao)力(li)是(shi)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)5倍(bei)。這(zhe)(zhe)些效(xiao)(xiao)力(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)與(yu)(yu)(yu)(yu)胞內體(ti)(ti)釋(shi)(shi)放(fang)(fang)增(zeng)加(jia)一(yi)致，可(ke)(ke)能(neng)(neng)是(shi)由(you)(you)胞內體(ti)(ti)釋(shi)(shi)放(fang)(fang)增(zeng)加(jia)引起的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，對(dui)(dui)(dui)于(yu)(yu)Lipid 5，細(xi)胞中(zhong)高(gao)達15%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA從胞內體(ti)(ti)釋(shi)(shi)放(fang)(fang)，而(er)(er)MC3為(wei)(wei)2.5%，后者與(yu)(yu)(yu)(yu)之前(qian)使(shi)用siRNA測定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果相(xiang)似(si)[106]。然而(er)(er)，在(zai)這(zhe)(zhe)些內體(ti)(ti)釋(shi)(shi)放(fang)(fang)實驗(yan)中(zhong)，MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞攝取是(shi)Lipid 5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)4倍(bei)，因此(ci)這(zhe)(zhe)兩種LNPs在(zai)細(xi)胞質(zhi)(zhi)(zhi)中(zhong)釋(shi)(shi)放(fang)(fang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)絕對(dui)(dui)(dui)量相(xiang)似(si)。在(zai)疫苗(miao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肌內給(gei)藥(yao)中(zhong)檢(jian)查了相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)電離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)庫(ku)，同樣發現可(ke)(ke)降(jiang)解(jie)(jie)，并且由(you)(you)于(yu)(yu)伯酯而(er)(er)迅速消除(chu)，并且對(dui)(dui)(dui)于(yu)(yu)流感核(he)苷修飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA%__，與(yu)(yu)(yu)(yu)MC3相(xiang)比(bi)，在(zai)蛋(dan)白表(biao)(biao)達或(huo)免疫原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)方(fang)面(mian)效(xiao)(xiao)價通(tong)(tong)常(chang)增(zeng)加(jia)3-6倍(bei)。小鼠中(zhong)%編碼的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫原(yuan)(yuan)，盡管非人(ren)靈長(chang)類(lei)動物(wu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)與(yu)(yu)(yu)(yu)5µg初免-加(jia)強免疫劑量下的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3相(xiang)同[42]。脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)H或(huo)SM-102（表(biao)(biao)2）被確定(ding)為(wei)(wei)最(zui)佳候選藥(yao)物(wu)，在(zai)結構上(shang)僅與(yu)(yu)(yu)(yu)通(tong)(tong)過伯酯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)碳置換確定(ding)為(wei)(wei)IV給(gei)藥(yao)最(zui)佳的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)5不(bu)同。脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)5 LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa為(wei)(wei)6.56，而(er)(er)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)H LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa為(wei)(wei)6.68，表(biao)(biao)明(ming)IM與(yu)(yu)(yu)(yu)IV給(gei)藥(yao)相(xiang)比(bi)，pKa略微增(zeng)加(jia)可(ke)(ke)能(neng)(neng)有(you)益，盡管該差異在(zai)試(shi)驗(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)異性(xing)(xing)范(fan)圍內。大(da)鼠肌肉注射(she)部位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)織學檢(jian)查表(biao)(biao)明(ming)，與(yu)(yu)(yu)(yu)MC3相(xiang)比(bi)，Lipid HLNPs吸引的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)中(zhong)性(xing)(xing)粒細(xi)胞和巨(ju)噬細(xi)胞富集(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)炎性(xing)(xing)浸潤較少，這(zhe)(zhe)可(ke)(ke)能(neng)(neng)會降(jiang)低(di)人(ren)體(ti)(ti)試(shi)驗(yan)中(zhong)注射(she)部位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)反應(ying)原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)[42]。

目前(qian)SARS-CoV-2臨(lin)床試驗中的mRNA脂質納米顆粒

5.1.BioNTech/Pfizer

Acuitas ALC-0315（表2）結合(he)DSPC、膽固(gu)醇和PEG脂質(zhi)是BioNTech SARS-COV-2試(shi)驗中的遞送系統[40]。CureVac和倫敦帝國理工(gong)學院(yuan)也可(ke)能使用(yong)(yong)ALC-0315，或可(ke)能使用(yong)(yong)A9（表2）。

BioNTech開(kai)始用4種(zhong)(zhong)mRNA編(bian)碼的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)原開(kai)發(fa)其(qi)SARS-CoV-2疫(yi)苗，其(qi)中2種(zhong)(zhong)是核苷修飾的(de)(de)(de)，1種(zhong)(zhong)是未修飾的(de)(de)(de)，1種(zhong)(zhong)是自我擴增(zeng)的(de)(de)(de)。有兩種(zhong)(zhong)核苷修飾的(de)(de)(de)mRNA的(de)(de)(de)報道：BNT162b1是編(bian)碼刺突(tu)蛋白(bai)受體結(jie)合(he)(he)域(yu)的(de)(de)(de)短的(de)(de)(de)~1kb序列(lie)，通過foldon三聚(ju)體結(jie)構域(yu)修飾，通過多(duo)價顯(xian)示增(zeng)加免(mian)(mian)疫(yi)原性。較長的(de)(de)(de)4.3kb BNT162b2編(bian)碼一個二(er)脯氨酸(suan)穩定(ding)的(de)(de)(de)全長膜(mo)結(jie)合(he)(he)刺突(tu)蛋白(bai)。BNT162b2最近獲得(de)了歐盟和美國的(de)(de)(de)緊急批準。

在(zai)一項臨床(chuang)前(qian)研究中(zhong)，小鼠(shu)單次(ci)給予0.2、1和(he)(he)5µg BNT162b2后，可(ke)檢測到結(jie)合(he)抗(kang)(kang)體和(he)(he)中(zhong)和(he)(he)滴(di)度(du)。從最低(di)劑量(liang)到最高(gao)劑量(liang)增(zeng)加一個數量(liang)級，在(zai)Th2細胞(bao)(bao)因子(zi)水平非常低(di)的CD4 + 和(he)(he)CD8 + 脾(pi)細胞(bao)(bao)中(zhong)引(yin)(yin)起強(qiang)烈(lie)的抗(kang)(kang)原(yuan)特(te)異(yi)性(xing)Th1 IFNγ和(he)(he)IL-2應(ying)(ying)答(da)[49]。引(yin)(yin)流(liu)淋巴(ba)結(jie)中(zhong)還含有(you)大量(liang)生發中(zhong)心(xin)B細胞(bao)(bao)以及CD4 + 和(he)(he)CD8 + 濾泡輔助性(xing)T(Tfh)細胞(bao)(bao)計數升高(gao)，這些細胞(bao)(bao)先前(qian)被確定為mRNA LNP疫(yi)苗中(zhong)LNP單獨誘導的一部分[33]。在(zai)非人(ren)靈長類動物中(zhong)，30µg或100µg的初(chu)免(mian)(mian)-加強(qiang)免(mian)(mian)疫(yi)劑量(liang)引(yin)(yin)起的結(jie)合(he)抗(kang)(kang)體和(he)(he)中(zhong)和(he)(he)滴(di)度(du)是人(ren)恢(hui)復(fu)期試驗(yan)組的10倍以上，并(bing)且產生強(qiang)烈(lie)的Th1偏(pian)倚T細胞(bao)(bao)應(ying)(ying)答(da)，該應(ying)(ying)答(da)被認(ren)為對預防疫(yi)苗相關的增(zeng)強(qiang)呼吸道疾病很重(zhong)要[107]。在(zai)有(you)限數量(liang)(6)的攻毒(du)恒(heng)河猴中(zhong)，兩次(ci)100µg劑量(liang)在(zai)支氣管肺泡灌洗和(he)(he)鼻拭子(zi)中(zhong)檢測不到病毒(du)滴(di)度(du)。

較小mRNA編碼免(mian)疫原BNT162b1的1期(qi)(qi)臨床試(shi)驗計劃在(zai)第(di)(di)1天和第(di)(di)21天給(gei)予(yu)10、30和100µg劑(ji)量。中(zhong)等劑(ji)量30µg誘導的抗(kang)體結合和中(zhong)和滴度(du)(du)分(fen)別是人恢復(fu)期(qi)(qi)組的30倍和3倍。由于首次給(gei)藥(yao)后存在(zai)重度(du)(du)注射部位(wei)疼(teng)痛，因(yin)此(ci)未給(gei)予(yu)100µg劑(ji)量進行加(jia)強(qiang)劑(ji)量。30µg加(jia)強(qiang)劑(ji)量組100%的受試(shi)者報告(gao)了注射部位(wei)疼(teng)痛，但(dan)嚴重程度(du)(du)為輕(qing)度(du)(du)或中(zhong)度(du)(du)。以30µg劑(ji)量第(di)(di)二次接種疫苗后，幾乎所有受試(shi)者均發(fa)生輕(qing)度(du)(du)或中(zhong)度(du)(du)全身不(bu)良事件發(fa)熱、寒戰或疲乏。該試(shi)驗還證明了外周(zhou)血(xue)單核(he)細胞(bao)(bao)對Th1偏倚(yi)T細胞(bao)(bao)的強(qiang)烈應答[50]。

一項2期試(shi)(shi)驗在(zai)年(nian)輕(qing)（18-55歲(sui)）和年(nian)長（65-85歲(sui)）受(shou)(shou)試(shi)(shi)者組中(zhong)比(bi)(bi)較了(le)(le)BNT162b1和BNT162b2[51]。老年(nian)受(shou)(shou)試(shi)(shi)者的結合(he)和中(zhong)和抗體(ti)滴度略低，但仍超過恢復期組。與(yu)年(nian)輕(qing)受(shou)(shou)試(shi)(shi)者相比(bi)(bi)，老年(nian)受(shou)(shou)試(shi)(shi)者的不良反應嚴(yan)重(zhong)程度也降低。與(yu)BNT162b1相比(bi)(bi)，在(zai)BNT162b2中(zhong)發(fa)現全身不良事件（發(fa)熱(re)、寒戰、疲乏）的頻率顯著降低約兩倍。正是(shi)BNT162b2耐(nai)受(shou)(shou)性的增加推動了(le)(le)其選擇進入3期試(shi)(shi)驗，最近(jin)宣布(bu)了(le)(le)94%的有效性，因為在(zai)安慰劑(ji)組中(zhong)發(fa)生了(le)(le)162例(li)COVID-19病例(li)，而(er)在(zai)接受(shou)(shou)兩次30µg BNT162b2給藥的疫苗接種(zhong)組中(zhong)僅(jin)發(fa)現了(le)(le)8例(li)病例(li)[3]

5.2. Moderna

在(zai)(zai)(zai)Moderna的(de)(de)(de)(de)研(yan)究中(zhong)(zhong)，核苷修飾的(de)(de)(de)(de)mRNA編碼免疫原是一種跨膜錨定的(de)(de)(de)(de)二脯氨酸(suan)穩(wen)定的(de)(de)(de)(de)融合前刺(ci)突，具有天然的(de)(de)(de)(de)furin裂解(jie)位點(dian)，并在(zai)(zai)(zai)原型MC3 LNP基(ji)礎上的(de)(de)(de)(de)LNP中(zhong)(zhong)遞(di)送(song)，只是用Lipid H(SM-102)替代MC3[41,42]。該mRNA LNP(mRNA-1273)在(zai)(zai)(zai)第1天和(he)(he)第21天以(yi)1µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)注射時(shi)(shi)在(zai)(zai)(zai)幾種小鼠(shu)種屬中(zhong)(zhong)誘(you)導中(zhong)(zhong)和(he)(he)抗(kang)體，但(dan)在(zai)(zai)(zai)0.1µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)時(shi)(shi)未(wei)誘(you)導中(zhong)(zhong)和(he)(he)抗(kang)體[44]。T細胞應(ying)答似乎(hu)是平(ping)衡的(de)(de)(de)(de)Th1/Th2應(ying)答，在(zai)(zai)(zai)小鼠(shu)適應(ying)的(de)(de)(de)(de)病(bing)毒(du)攻(gong)毒(du)模型中(zhong)(zhong)，小鼠(shu)肺和(he)(he)鼻(bi)甲中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)病(bing)毒(du)滴(di)度(du)(du)(du)在(zai)(zai)(zai)2次劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)1µg給藥后(hou)(hou)降低(di)至(zhi)基(ji)線(xian)，但(dan)在(zai)(zai)(zai)0.1µg給藥后(hou)(hou)未(wei)降低(di)。在(zai)(zai)(zai)恒河猴中(zhong)(zhong)，2劑(ji)(ji)(ji)100µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)在(zai)(zai)(zai)外周血中(zhong)(zhong)產生高結合和(he)(he)中(zhong)(zhong)和(he)(he)滴(di)度(du)(du)(du)以(yi)及Th1偏(pian)倚反(fan)應(ying)，也涉(she)及強烈的(de)(de)(de)(de)Tfh反(fan)應(ying)[45]。兩(liang)個10µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)組(zu)的(de)(de)(de)(de)滴(di)度(du)(du)(du)和(he)(he)T細胞應(ying)答顯著降低(di)。同(tong)樣，100µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)能夠將支(zhi)氣(qi)管肺泡灌(guan)洗液和(he)(he)鼻(bi)拭子中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)病(bing)毒(du)滴(di)度(du)(du)(du)降低(di)至(zhi)基(ji)線(xian)，而(er)10µg僅在(zai)(zai)(zai)肺部降低(di)。

在(zai)(zai)1期(qi)研究中，每(mei)組(zu)(zu)15例(li)(li)患(huan)者(zhe)接(jie)受(shou)2劑(ji)(ji)(ji)(ji)25、100或(huo)250µg，間隔4周，結(jie)合和(he)(he)(he)中和(he)(he)(he)滴(di)(di)度比(bi)(bi)100µg劑(ji)(ji)(ji)(ji)量的(de)(de)(de)(de)恢(hui)(hui)復(fu)(fu)期(qi)高(gao)(gao)約(yue)10倍，約(yue)相(xiang)當于25µg的(de)(de)(de)(de)恢(hui)(hui)復(fu)(fu)期(qi)[46]。100µg和(he)(he)(he)250µg劑(ji)(ji)(ji)(ji)量組(zu)(zu)所有(you)受(shou)試者(zhe)均報告征集性(xing)(xing)不(bu)良事件(jian)，250µg組(zu)(zu)14例(li)(li)受(shou)試者(zhe)中的(de)(de)(de)(de)3例(li)(li)報告重(zhong)度不(bu)良事件(jian)并(bing)停(ting)藥。在(zai)(zai)隨后的(de)(de)(de)(de)老年(nian)(nian)患(huan)者(zhe)（56-71歲(sui)和(he)(he)(he)71歲(sui)以上）1期(qi)研究中，發(fa)現25µg和(he)(he)(he)100µg劑(ji)(ji)(ji)(ji)量產生的(de)(de)(de)(de)結(jie)合抗體滴(di)(di)度高(gao)(gao)于恢(hui)(hui)復(fu)(fu)期(qi)血(xue)(xue)漿，而(er)100µg劑(ji)(ji)(ji)(ji)量的(de)(de)(de)(de)中和(he)(he)(he)滴(di)(di)度相(xiang)當，但低(di)于25µg劑(ji)(ji)(ji)(ji)量的(de)(de)(de)(de)恢(hui)(hui)復(fu)(fu)期(qi)[43]。大多數患(huan)者(zhe)（約(yue)80%）在(zai)(zai)第(di)二次接(jie)種(zhong)疫苗(miao)后仍發(fa)生不(bu)良事件(jian)，即使是在(zai)(zai)老年(nian)(nian)組(zu)(zu)。外周血(xue)(xue)分析顯示CD4 T細胞應答存在(zai)(zai)Th1偏倚(yi)。與25µg劑(ji)(ji)(ji)(ji)量相(xiang)比(bi)(bi)，100µg劑(ji)(ji)(ji)(ji)量的(de)(de)(de)(de)中和(he)(he)(he)滴(di)(di)度更高(gao)(gao)，因此選擇該(gai)劑(ji)(ji)(ji)(ji)量用于3期(qi)試驗(yan)，中期(qi)結(jie)果顯示90例(li)(li)COVID-19病例(li)(li)在(zai)(zai)安慰劑(ji)(ji)(ji)(ji)組(zu)(zu)與5例(li)(li)在(zai)(zai)疫苗(miao)接(jie)種(zhong)組(zu)(zu)具有(you)94.5%的(de)(de)(de)(de)有(you)效性(xing)(xing)[2]。一個獨立的(de)(de)(de)(de)委員會(hui)對Moderna的(de)(de)(de)(de)3期(qi)試驗(yan)進行(xing)了中期(qi)分析，發(fa)現嚴重(zhong)不(bu)良事件(jian)包(bao)括9.7%的(de)(de)(de)(de)參與者(zhe)出(chu)現疲(pi)勞(lao)，8.9%出(chu)現肌肉疼痛(tong)，5.2%出(chu)現關節痛(tong)，4.5%出(chu)現頭(tou)痛(tong)，而(er)在(zai)(zai)輝瑞/BioNTech的(de)(de)(de)(de)3期(qi)試驗(yan)中，頻率較低(di)的(de)(de)(de)(de)是疲(pi)勞(lao)為3.8%，頭(tou)痛(tong)為2%[108]。

5.3. CureVac

The CureVac mRNA LNP(CVnCoV)是(shi)一種非化學(xue)修飾的(de)序列工程mRNA，編碼在(zai)Acuitas LNP中(zhong)(zhong)遞送的(de)二(er)脯氨酸(suan)穩定的(de)全長S蛋白，可能使用(yong)可電(dian)離脂質ALC-0315。在(zai)小(xiao)鼠(shu)中(zhong)(zhong)使用(yong)2µg劑(ji)量時，檢查了兩次(ci)給(gei)(gei)藥之間的(de)周數，范圍為1-4周，發(fa)現Balb/c小(xiao)鼠(shu)中(zhong)(zhong)較長的(de)間隔產生了較高的(de)滴(di)度和T細(xi)胞應答以及平衡的(de)Th1/Th2應答[53]。需要第二(er)次(ci)給(gei)(gei)藥以產生中(zhong)(zhong)和抗體，0.25µg的(de)兩次(ci)給(gei)(gei)藥不(bu)足(zu)以產生中(zhong)(zhong)和抗體。在(zai)敘利(li)亞(ya)金黃地鼠(shu)中(zhong)(zhong)，兩次(ci)10µg劑(ji)量（而(er)非2µg）能夠將肺(fei)（而(er)非鼻甲）中(zhong)(zhong)的(de)病毒滴(di)度降低至基線。

在檢查2-12µg劑(ji)(ji)量的(de)1期(qi)(qi)臨床試驗(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)，僅在最高12µg劑(ji)(ji)量下發現達到恢復期(qi)(qi)血清水平的(de)中(zhong)(zhong)(zhong)和滴度(du)，導致(zhi)正在進(jin)行的(de)2期(qi)(qi)試驗(yan)納入(ru)更高劑(ji)(ji)量16和20µg[52]。接(jie)受12µg劑(ji)(ji)量的(de)所(suo)有患(huan)者在每(mei)次給藥(yao)后均發生全身不(bu)良事件，大多(duo)數為中(zhong)(zhong)(zhong)度(du)和重度(du)，而 > 80%的(de)患(huan)者在輕度(du)和中(zhong)(zhong)(zhong)度(du)水平發生局部(bu)(bu)注射部(bu)(bu)位疼(teng)痛。

5.4. TranslateBio

Translate Bio使用(yong)非修飾的(de)(de)(de)(de)mRNA編碼(ma)雙突變(bian)形式的(de)(de)(de)(de)二(er)脯(fu)氨酸(suan)穩定的(de)(de)(de)(de)刺突蛋(dan)白，并通過被引(yin)用(yong)為(wei)基于(yu)可(ke)電(dian)離脂質C12-200[109]的(de)(de)(de)(de)LNP進行遞(di)送，其可(ke)能(neng)是(shi)最(zui)近(jin)從ICE-[110]或基于(yu)半(ban)胱氨酸(suan)的(de)(de)(de)(de)[55]可(ke)電(dian)離脂質家(jia)族(zu)合成的(de)(de)(de)(de)候選物(wu)。在(zai)Balb/c小鼠中，0.2–10µg范圍內的(de)(de)(de)(de)兩(liang)次給藥導致結合和中和滴(di)度遠高(gao)于(yu)恢(hui)(hui)復期(qi)(qi)水平。在(zai)非人(ren)靈(ling)長類(lei)動物(wu)中，15、45和135µg劑(ji)量產生的(de)(de)(de)(de)滴(di)度均超過人(ren)恢(hui)(hui)復期(qi)(qi)組(zu)[56]。免(mian)疫應答也存(cun)在(zai)Th1偏(pian)倚(yi)。

5.5. Arcturus

Arcturus使用自擴增(zeng)、全長、未(wei)修飾的(de)(de)mRNA編(bian)碼融合前(qian)SARS-CoV-2全長刺突蛋白，通過(guo)LNP進(jin)行遞送，該LNP使用可(ke)電(dian)離脂(zhi)質(zhi)與硫酯(zhi)，通過(guo)兩個(ge)額外的(de)(de)酯(zhi)基(ji)將含胺的(de)(de)頭基(ji)與脂(zhi)質(zhi)尾部連(lian)接(jie)。該家族中兩種可(ke)能的(de)(de)可(ke)電(dian)離脂(zhi)質(zhi)是脂(zhi)質(zhi)10a（[111]的(de)(de)表4）或脂(zhi)質(zhi)2,2(8,8)4 C CH3（[57]的(de)(de)第33頁）（表2）。后者有(you)(you)三個(ge)分(fen)支，類似于Moderna Lipid H，但有(you)(you)一個(ge)可(ke)降解的(de)(de)硫酯(zhi)與頭基(ji)連(lian)接(jie)。觀(guan)察到自身(shen)擴增(zeng)mRNA的(de)(de)特征，即IM給(gei)藥后1周(zhou)以(yi)上，熒光素酶報告基(ji)因表達維持在相當(dang)恒(heng)定的(de)(de)水(shui)平，而常規mRNA表達迅速下降[58]。

單(dan)獨接種疫(yi)苗在(zai)C57BL/6小(xiao)鼠中(zhong)產(chan)生(sheng)了(le)令人(ren)驚訝地體重(zhong)減輕和(he)臨(lin)床評(ping)分增加。小(xiao)鼠中(zhong)僅(jin)需要(yao)2µg或(huo)10µg（而非0.2µg）單(dan)次(ci)給藥(yao)，即可在(zai)Th1偏倚(yi)應(ying)答中(zhong)達到(dao)高于100的中(zhong)和(he)滴(di)度(du)，并(bing)具有高水(shui)平(ping)的抗原特異性T細胞(bao)應(ying)答。在(zai)K18-hACE2致死小(xiao)鼠激發模型中(zhong)，2µg或(huo)10µg單(dan)次(ci)給藥(yao)也具有100%保護作用，100%存活，無體重(zhong)減輕，肺和(he)腦(nao)病毒滴(di)度(du)降低至基(ji)線水(shui)平(ping)。Arcturus已經完成了(le)1期(qi)臨(lin)床試(shi)驗，劑量為1-10µg，并(bing)選(xuan)擇7.5µg進(jin)行3期(qi)試(shi)驗[112]。

5.6.帝國理工學院

倫敦帝國理工學院使用Acuitas LNP遞送(song)的(de)自擴增mRNA編碼的(de)融合前(qian)穩定(ding)的(de)刺突蛋白，該(gai)LNP在(zai)Lipid A9[60]代表的(de)專利(li)[59]中進(jin)行(xing)了(le)描述（表2）。在(zai)Balb/c小鼠兩次注射0.01µg至10µg劑(ji)量(liang)(liang)范圍(wei)后，獲得(de)了(le)較高的(de)劑(ji)量(liang)(liang)依賴性抗體(ti)和中和滴度。該(gai)應答存(cun)在(zai)強烈的(de)Th1偏(pian)倚，與較低的(de)0.1和0.01µg劑(ji)量(liang)(liang)相比(bi)，10和1µg劑(ji)量(liang)(liang)產生的(de)抗原(yuan)特異性脾細胞應答高3倍(bei)。這種疫苗的(de)1期臨床試驗即將開(kai)始。

5.7.朱拉隆(long)功大學、賓夕法尼亞(ya)大學

朱拉隆功大學與(yu)賓夕法尼亞大學合作，正在使用Genevant LNP（可能是(shi)CL1脂(zhi)質）開(kai)發一(yi)種天然的(de)(de)(de)加(jia)標免疫原核苷修飾(shi)的(de)(de)(de)mRNA LNP[61]。他們(men)的(de)(de)(de)目標是(shi)在2021年(nian)第(di)1季(ji)度開(kai)始(shi)1期臨床試驗，并在2021年(nian)第(di)4季(ji)度開(kai)始(shi)將(jiang)疫苗分發給泰國(guo)和7個(ge)周圍(wei)的(de)(de)(de)低(di)至中等收入國(guo)家。

5.8. Providence Therapeutics

Providence Therapeutics被授予加(jia)拿(na)大(da)衛(wei)生(sheng)部許可進(jin)(jin)行(xing)PTX-COVID-19B mRNA LNP疫(yi)苗人體臨(lin)床(chuang)試驗(yan)的(de)通知[113]。C57BL6小鼠按照初(chu)免-加(jia)強免疫(yi)方案接受(shou)20µg劑量給(gei)藥后(hou)，對(dui)編碼受(shou)體結合域（furin裂解位點(dian)有(you)或無(wu)突變(bian)的(de)全長加(jia)標物(wu)(wu)）的(de)三種(zhong)mRNA候選物(wu)(wu)進(jin)(jin)行(xing)臨(lin)床(chuang)前(qian)(qian)研究(jiu)[114]。來(lai)自Genevant未披(pi)露脂質的(de)臨(lin)床(chuang)前(qian)(qian)數(shu)據(ju)結果(guo)（可能與(yu)表(biao)2中的(de)CL1相似(si)）顯示出(chu)對(dui)于全長和(he)furin突變(bian)有(you)效負(fu)載(zai)的(de)穩健中和(he)滴度(du)，與(yu)[115]中觀察到(dao)的(de)數(shu)據(ju)相似(si)。1期臨(lin)床(chuang)試驗(yan)計劃于2021年第一季度(du)開始(shi)，疫(yi)苗的(de)生(sheng)產和(he)分銷(xiao)——等待監管批準——在(zai)同年進(jin)(jin)行(xing)。

5.9.儲存和分銷

大(da)多數在(zai)(zai)(zai)實驗室中制(zhi)造(zao)的RNA LNPs在(zai)(zai)(zai)4 °C下可(ke)穩定(ding)數天(tian)，但隨(sui)后(hou)表現(xian)出體(ti)積增大(da)和(he)生物活性逐漸喪失，如熒光(guang)素(su)酶表達(da)[116]。在(zai)(zai)(zai)之(zhi)前的siRNA LNP制(zhi)劑中，通常觀(guan)察到LNP聚集的大(da)小(xiao)隨(sui)時(shi)間(jian)增加[117]。為(wei)了穩定(ding)用(yong)于儲(chu)存(cun)和(he)分銷的mRNA LNP疫苗，迄今為(wei)止需要冷凍形式(shi)。Moderna COVID-19疫苗需要在(zai)(zai)(zai)-25 ℃～-15 ℃保(bao)存(cun)，但在(zai)(zai)(zai)2 ℃～8 ℃之(zhi)間(jian)也可(ke)穩定(ding)長達(da)30天(tian)，在(zai)(zai)(zai)8 ℃～25 ℃之(zhi)間(jian)可(ke)穩定(ding)長達(da)12 h[118]。輝瑞/BioNTech COVID-19疫苗需要在(zai)(zai)(zai)-80 ℃至-60 ℃下儲(chu)存(cun)，然(ran)后(hou)解凍并在(zai)(zai)(zai)2 ℃至8 ℃下儲(chu)存(cun)長達(da)5天(tian)，然(ran)后(hou)在(zai)(zai)(zai)注射(she)前用(yong)生理鹽水稀釋[119]。

與Moderna疫(yi)苗所需(xu)(xu)的(de)(de)常規冷(leng)凍(dong)溫(wen)度相比，輝瑞疫(yi)苗在分銷和儲存(cun)期間所需(xu)(xu)的(de)(de)干(gan)冰溫(wen)度更難(nan)達到。這(zhe)些溫(wen)差背(bei)后的(de)(de)原因并不明顯(xian)，因為(wei)(wei)兩種疫(yi)苗均含有(you)相似的(de)(de)高濃度蔗(zhe)糖(tang)作為(wei)(wei)冷(leng)凍(dong)保護劑。Moderna mRNA LNPs在Tris和醋(cu)酸(suan)(suan)鹽兩種緩沖液中(zhong)冷(leng)凍(dong)[41]，而(er)Pfizer/BioNTech疫(yi)苗僅使用磷酸(suan)(suan)鹽緩沖液[40]。已知磷酸(suan)(suan)鹽緩沖液對(dui)冷(leng)凍(dong)不理想(xiang)，因為(wei)(wei)其易于(yu)沉淀，并在冰結晶開始時(shi)引起pH值突然變(bian)化[120,121]。凍(dong)干(gan)對(dui)于(yu)mRNA LNPs一直具(ju)有(you)挑戰(zhan)性[116]。然而(er)，Arcturus表示，他們的(de)(de)COVID-19 mRNA疫(yi)苗在凍(dong)干(gan)形式下是(shi)穩定的(de)(de)，這(zhe)大(da)概會大(da)大(da)簡化分布，盡管(guan)這(zhe)種凍(dong)干(gan)制(zhi)劑的(de)(de)溫(wen)度穩定性尚(shang)未披露[122]。

原文來源：Automated Manufacture of Autologous CD19 CAR-T Cells for Treatment of Non-hodgkin Lymphoma.Front.Immunol.11:1941. DOI:10.3389/fimmu.2020.01941