概要：脂質納米顆粒（LNPs）是一種具有均勻脂質核的脂囊泡，被廣泛應用于小分子藥物和核酸輸送，最近因為在COVID-19 mRNA疫苗遞送平臺取得的顯著成功引起了廣泛的關注。然而，mRNA誘導的短暫蛋白表達的應用并不僅僅用于傳染性疾病的疫苗領域，也為癌癥疫苗、蛋白質替代療法和罕見遺傳疾病的基因編輯組件提供了新的途徑。然而，未包覆的mRNA本身并不穩定，很容易由于核酸酶和自水解快速降解。經LNPs包覆的mRNA可以免受細胞外核糖核酸酶的影響，并有助于細胞內mRNA的遞送。在這(zhe)篇文(wen)章中，我們將(jiang)討(tao)論RNA遞(di)送所使用LNPs的(de)核(he)心特征。本(ben)文(wen)將(jiang)聚(ju)焦于mRNA遞(di)送用LNPs；然而，也相應地列舉了(le)siRNA-LNP遞(di)送的(de)例子(zi)，以(yi)突出核(he)酸結構造(zao)成的(de)共(gong)性和差(cha)異(yi)。首先，將介(jie)紹LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)念(nian)，利用(yong)核酸(suan)(suan)作(zuo)為(wei)(wei)治(zhi)療藥物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)優點(dian)和(he)缺點(dian)，以及LNPs分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)構(gou)成(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一般推理；同(tong)時簡(jian)要(yao)介(jie)紹了(le)(le)臨床上基(ji)(ji)于LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)核酸(suan)(suan)治(zhi)療的(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)新成(cheng)功(gong)經(jing)驗。其次，闡述了(le)(le)LNP自組裝的(de)(de)(de)(de)(de)(de)理論和(he)方法。所(suo)有(you)制(zhi)備方法的(de)(de)(de)(de)(de)(de)共同(tong)理念(nian)是誘(you)導核酸(suan)(suan)和(he)帶電脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靜電相(xiang)互作(zuo)用(yong)，并通過疏水作(zuo)用(yong)促(cu)進納米顆(ke)粒的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生長。第三，根據基(ji)(ji)本性(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)和(he)用(yong)途對(dui)LNP進行成(cheng)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)解，包(bao)括(kuo)公認的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)設計標(biao)準、商(shang)業來源(yuan)，對(dui)細(xi)胞內運輸(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響，以及對(dui)LNPs性(xing)能的(de)(de)(de)(de)(de)(de)貢獻(xian)。LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)關鍵成(cheng)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)之(zhi)一是啟動(dong)與(yu)內吞體(ti)(ti)膜的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靜電結合、并促(cu)進胞質(zhi)(zhi)(zhi)釋放的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可電離脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)；然而(er)，其他脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)成(cheng)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)也不應忽視(shi)，因(yin)為(wei)(wei)它(ta)們與(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩(wen)定性(xing)、間隙和(he)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)布密切相(xiang)關。第四，從(cong)整體(ti)(ti)上回顧了(le)(le)對(dui)RNA遞送有(you)重要(yao)影響的(de)(de)(de)(de)(de)(de)LNP結構(gou)屬(shu)性(xing)，包(bao)括(kuo)LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)尺寸、電荷、內部結構(gou)、脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)封裝、脂(zhi)(zhi)(zhi)膜水合作(zuo)用(yong)、穩(wen)定性(xing)和(he)對(dui)生物大(da)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)親和(he)性(xing)；還(huan)將討論這些屬(shu)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢測技術以及調控方法。最后，展(zhan)望了(le)RNA療(liao)法的未來，并提出了(le)LNP配方和優(you)化領域中存在的一些問題。

1.引言

近年(nian)來(lai)，脂(zhi)質納(na)米顆粒（LNPs）顯示其(qi)在(zai)RNA疫苗(miao)和(he)(he)療法中作為(wei)遞(di)(di)送系統(tong)的(de)(de)(de)的(de)(de)(de)實用(yong)(yong)性。無(wu)包覆的(de)(de)(de)RNA是一種(zhong)(zhong)帶(dai)負(fu)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷的(de)(de)(de)親水大分(fen)子，由(you)(you)于(yu)(yu)細胞(bao)(bao)膜的(de)(de)(de)靜電(dian)(dian)(dian)(dian)排斥，很難進入細胞(bao)(bao)，并(bing)被(bei)無(wu)所不在(zai)的(de)(de)(de)核(he)糖(tang)核(he)酸(suan)酶（RNase）迅速降解(jie)。因(yin)此(ci)，它需要(yao)(yao)一個(ge)保護層以(yi)(yi)(yi)(yi)增加進入細胞(bao)(bao)內部機會。由(you)(you)于(yu)(yu)細胞(bao)(bao)膜主要(yao)(yao)由(you)(you)脂(zhi)質構(gou)(gou)成(cheng)，因(yin)此(ci)，使用(yong)(yong)脂(zhi)質體(ti)(ti)包覆RNA可以(yi)(yi)(yi)(yi)使RNA更(geng)容易通(tong)(tong)過(guo)細胞(bao)(bao)膜并(bing)將(jiang)其(qi)釋放到細胞(bao)(bao)質中。為(wei)了(le)實現這個(ge)目的(de)(de)(de)，脂(zhi)質體(ti)(ti)首(shou)先需要(yao)(yao)一個(ge)帶(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)的(de)(de)(de)脂(zhi)粒，可以(yi)(yi)(yi)(yi)附著在(zai)帶(dai)負(fu)電(dian)(dian)(dian)(dian)的(de)(de)(de)RNA上。然(ran)而(er)，由(you)(you)永久性陽離(li)子脂(zhi)粒組成(cheng)的(de)(de)(de)脂(zhi)質體(ti)(ti)會對帶(dai)負(fu)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)膜產生靜電(dian)(dian)(dian)(dian)破壞(huai)從而(er)引起細胞(bao)(bao)毒(du)性。因(yin)此(ci)，脂(zhi)質結構(gou)(gou)被(bei)進一步改進，通(tong)(tong)過(guo)酸(suan)性內溶酶體(ti)(ti)途徑獲得正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷；LNP成(cheng)分(fen)也擴(kuo)展到了(le)結構(gou)(gou)脂(zhi)類(lei)（模擬細胞(bao)(bao)膜并(bing)屏蔽正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷）和(he)(he)聚(ju)（乙二醇(chun)）-錨(mao)定脂(zhi)類(lei)（防止LNPs聚(ju)集以(yi)(yi)(yi)(yi)及與(yu)生物環境的(de)(de)(de)副(fu)反應）。從FDA批準了(le)首(shou)個(ge)siRNA-LNP藥物（Onpattro）和(he)(he)mRNA-LNP新(xin)冠疫苗(miao)（Comirnaty）以(yi)(yi)(yi)(yi)及Moderna新(xin)冠疫苗(miao)的(de)(de)(de)緊急(ji)使用(yong)(yong)授權（EUA）等這些(xie)該領域的(de)(de)(de)主要(yao)(yao)監管里程(cheng)碑(bei)事件可以(yi)(yi)(yi)(yi)明顯看出，基(ji)于(yu)(yu)LNP的(de)(de)(de)核(he)酸(suan)遞(di)(di)送方法是安全(quan)的(de)(de)(de)，適用(yong)(yong)于(yu)(yu)各種(zhong)(zhong)療法。然(ran)而(er)，目前還沒有適合所有疾病的(de)(de)(de)萬能(neng)方案，因(yin)此(ci)LNP的(de)(de)(de)優化工作依(yi)舊任重道遠。本文將(jiang)討論用(yong)(yong)于(yu)(yu)選擇(ze)RNA-LNP遞(di)(di)送脂(zhi)類(lei)所需的(de)(de)(de)主要(yao)(yao)科學(xue)和(he)(he)制造概(gai)念。

2.制(zhi)備

LNP的(de)(de)制備依賴于自組(zu)裝(zhuang)能(neng)力，即脂(zhi)質成分(fen)在(zai)分(fen)子間(jian)相互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)(de)基礎上自發組(zu)裝(zhuang)成納米實體。LNP的(de)(de)形成從帶(dai)負電荷的(de)(de)核酸(suan)和帶(dai)正電荷的(de)(de)脂(zhi)類之間(jian)的(de)(de)靜電結合(he)開始(shi)。然(ran)后，LNPs通(tong)過疏水性和脂(zhi)質組(zu)分(fen)之間(jian)相互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)(de)范德華(hua)力增長(chang)。由于脂(zhi)質的(de)(de)多樣(yang)性、核酸(suan)的(de)(de)獨特(te)性及(ji)兩(liang)者混合(he)過程的(de)(de)瞬時性，對自組(zu)裝(zhuang)的(de)(de)早(zao)期階段(duan)及(ji)其對LNP最終(zhong)性質的(de)(de)相關影響的(de)(de)表征仍然(ran)極具(ju)挑(tiao)戰。此外(wai)，LNP制造協議(yi)至少(shao)在(zai)兩(liang)個方面(mian)影響產(chan)品的(de)(de)自組(zu)裝(zhuang): LNPs的(de)(de)均勻性和核酸(suan)負載(zai)效率。

LNP有多(duo)種制備(bei)(bei)方(fang)法(fa)，如脂(zhi)膜泡擠出(chu)法(fa)、脂(zhi)膜再水化、納米沉淀(dian)法(fa)和(he)微(wei)(wei)(wei)流體混(hun)合(he)法(fa)。然(ran)而，通(tong)常的(de)(de)(de)(de)制備(bei)(bei)方(fang)法(fa)是(shi)將水和(he)脂(zhi)質(zhi)組分快速混(hun)合(he)。微(wei)(wei)(wei)流控(kong)技術(shu)以(yi)其良(liang)好(hao)的(de)(de)(de)(de)重復性而成(cheng)為當前臨床前研(yan)究的(de)(de)(de)(de)首(shou)選方(fang)法(fa)。新型(xing)微(wei)(wei)(wei)流控(kong)設備(bei)(bei)制造取得的(de)(de)(de)(de)進(jin)展使這(zhe)(zhe)種方(fang)法(fa)更容易實現，采(cai)用平(ping)行微(wei)(wei)(wei)流體通(tong)道或改(gai)進(jin)的(de)(de)(de)(de)傳統方(fang)法(fa)（如移液(ye)管(guan)混(hun)合(he)和(he)t型(xing)混(hun)合(he)器）等(deng)其他途徑也可以(yi)實現LNPs的(de)(de)(de)(de)高通(tong)量制備(bei)(bei)。一般來講，微(wei)(wei)(wei)流體混(hun)合(he)有利(li)于將親(qin)水性部(bu)分封裝(zhuang)到疏水的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)核(he)心中，但這(zhe)(zhe)一過(guo)程并不能嚴(yan)格需(xu)要(yao)核(he)酸的(de)(de)(de)(de)參與(yu)。Kulkarni等(deng)報道，只要(yao)脂(zhi)質(zhi)核(he)心形(xing)成(cheng)，LNPs可以(yi)在T型(xing)混(hun)合(he)器內與(yu)siRNA完成(cheng)組裝(zhuang)。總(zong)的(de)(de)(de)(de)來說，混(hun)合(he)方(fang)式(shi)的(de)(de)(de)(de)特性可能會影響LNPs的(de)(de)(de)(de)組裝(zhuang)效(xiao)率(lv)和(he)內部(bu)結構(gou)，而自(zi)組裝(zhuang)過(guo)程的(de)(de)(de)(de)動力學(xue)因(yin)數則會決定最(zui)終的(de)(de)(de)(de)納米結構(gou)。

3.配(pei)方

3.1陽離子和可電(dian)離脂質

陽離子脂(zhi)(zhi)(zhi)質（CLs）和(he)(he)可電(dian)離脂(zhi)(zhi)(zhi)質（ILs）通過靜電(dian)相互(hu)作用啟動(dong)自(zi)組裝的(de)(de)(de)第一(yi)步(bu)。含有CLs的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質體(ti)(ti)仍被(bei)(bei)廣泛(fan)用于(yu)核(he)酸遞送(song)。然而，由于(yu)毒(du)性(xing)(xing)問題和(he)(he)缺乏體(ti)(ti)內療效，它(ta)們(men)已(yi)被(bei)(bei)對pH敏感(gan)的(de)(de)(de)ILs所(suo)取代(dai)。當被(bei)(bei)配(pei)制(zhi)成(cheng)LNPs時(shi)，ILs被(bei)(bei)設(she)計成(cheng)在(zai)生理pH下顯(xian)示電(dian)中(zhong)性(xing)(xing)，但在(zai)酸性(xing)(xing)核(he)內體(ti)(ti)內則表現為(wei)帶正電(dian)荷。這種pH適應(ying)的(de)(de)(de)電(dian)離性(xing)(xing)使其功效提升同時(shi)毒(du)性(xing)(xing)降低(di)，從而更適合于(yu)核(he)酸遞送(song)。這些脂(zhi)(zhi)(zhi)類通常(chang)占配(pei)方中(zhong)總脂(zhi)(zhi)(zhi)類的(de)(de)(de)30-50%。許多研究致力于(yu)微調ILs的(de)(de)(de)屬性(xing)(xing)，以進一(yi)步(bu)提高效率，特別是在(zai)難(nan)以觸及(ji)(ji)的(de)(de)(de)組織。CLs和(he)(he)ILs的(de)(de)(de)整體(ti)(ti)結構可以分為(wei)三個部分：（1）頭(tou)基、（2）連接體(ti)(ti)及(ji)(ji)（3）尾部（圖(tu)1）。

圖(tu)1 CLs和ILs結構及(ji)組件（頭(tou)基、連接(jie)體及(ji)尾部）示意(yi)圖(tu)

頭基 ILs的(de)頭基通(tong)常(chang)帶(dai)正電(dian)荷。頭基的(de)大小和(he)電(dian)荷密度(du)對核酸包(bao)覆、LNP穩(wen)定、與細(xi)胞膜相互作(zuo)(zuo)用以及促進核內(nei)體(ti)中的(de)釋放有重(zhong)要作(zuo)(zuo)用。ILs也(ye)可(ke)能(neng)有多(duo)個可(ke)電(dian)離的(de)頭基，盡管通(tong)常(chang)情況下(xia)只有一(yi)個。典型的(de)基包(bao)括胺（從一(yi)級(ji)(ji)到(dao)四級(ji)(ji)）、胍和(he)雜環群 （見圖(tu)1）。臨床應用的(de)ILs（DLin-MC3-DMA、SM-102和(he)ALC-0315；見圖(tu)2）包(bao)含(han)具有pH適(shi)應電(dian)離性的(de)叔胺頭基。ALC-0315和(he)SM-102頭基中也(ye)含(han)有末端羥基，可(ke)以減(jian)少頭基的(de)水合作(zuo)(zuo)用，并提高其與核酸的(de)氫(qing)鍵作(zuo)(zuo)用，可(ke)能(neng)會提高轉染能(neng)力(li)。

圖2 特定(ding)ILs結構及cpKa和(he)cLogP值(zhi)

連(lian)(lian)接(jie)體(ti) 連(lian)(lian)接(jie)體(ti)通(tong)常連(lian)(lian)接(jie)頭基(ji)(ji)與尾(wei)部，也可(ke)能(neng)包(bao)含在(zai)尾(wei)部內（SM-102和ALC-0315；見圖(tu)2）。連(lian)(lian)接(jie)體(ti)會(hui)影響LNPs的(de)(de)穩(wen)定性(xing)(xing)(xing)、生(sheng)(sheng)物降解(jie)(jie)性(xing)(xing)(xing)、細(xi)胞毒性(xing)(xing)(xing)和轉染效(xiao)率。在(zai)CLs和ILs設(she)計中使用的(de)(de)常用連(lian)(lian)接(jie)器如圖(tu)1所示。ILs可(ke)能(neng)包(bao)含一(yi)個或多(duo)(duo)個連(lian)(lian)接(jie)體(ti)；然而，為(wei)了(le)便(bian)于(yu)合(he)成，大多(duo)(duo)數ILs只含有一(yi)種類(lei)(lei)型的(de)(de)連(lian)(lian)接(jie)體(ti)。連(lian)(lian)接(jie)體(ti)可(ke)分為(wei)不可(ke)生(sheng)(sheng)物降解(jie)(jie)型（如醚類(lei)(lei)和氨基(ji)(ji)甲酸(suan)酯類(lei)(lei)）和可(ke)生(sheng)(sheng)物降解(jie)(jie)型（如酯類(lei)(lei)、酰胺(an)類(lei)(lei)和硫醇類(lei)(lei)）。生(sheng)(sheng)物可(ke)降解(jie)(jie)連(lian)(lian)接(jie)體(ti)由于(yu)可(ke)在(zai)體(ti)內被(bei)(bei)快(kuai)速清(qing)除，通(tong)常被(bei)(bei)作為(wei)首選(xuan)，以確保多(duo)(duo)次給藥并(bing)減少(shao)潛在(zai)的(de)(de)副作用。值得(de)注意的(de)(de)是，DLin-MC3-DMA，ALC-0315和SM-102都(dou)含有酯類(lei)(lei)連(lian)(lian)接(jie)體(ti)。對于(yu)SM-102，酯基(ji)(ji)團周(zhou)圍的(de)(de)修飾被(bei)(bei)證實(shi)會(hui)影響LNPs的(de)(de)清(qing)除、穩(wen)定性(xing)(xing)(xing)和轉染效(xiao)率。

尾(wei)(wei)部 疏(shu)(shu)水性(xing)的尾(wei)(wei)部會(hui)影(ying)響(xiang)pKa、親脂性(xing)、流(liu)動(dong)性(xing)和(he)(he)(he)融(rong)合性(xing)，從而影(ying)響(xiang)納米顆(ke)粒的形成和(he)(he)(he)效力。通(tong)(tong)常，一(yi)個(ge)IL包含(han)1到4個(ge)由8到20個(ge)碳原子組成的飽(bao)和(he)(he)(he)或不(bu)飽(bao)和(he)(he)(he)的疏(shu)(shu)水性(xing)尾(wei)(wei)部。不(bu)飽(bao)和(he)(he)(he)程度已被(bei)證(zheng)明通(tong)(tong)過調節膜(mo)不(bu)穩定(ding)相關方面影(ying)響(xiang)核(he)酸的遞送。DLin-MC3-DMA有(you)兩(liang)條亞油(you)基尾(wei)(wei)部，而ALC-0315和(he)(he)(he)SM-102包含(han)兩(liang)個(ge)假定(ding)為錐形的分(fen)叉飽(bao)和(he)(he)(he)尾(wei)(wei)部，有(you)助于對(dui)核(he)內體膜(mo)的去穩定(ding)作用和(he)(he)(he)核(he)酸在(zai)細胞溶質(zhi)的釋放。

ILs可以被看作是(shi)多(duo)組分分子(zi)，其中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)每個部(bu)分都需要被精確設(she)計(ji)，以便安全(quan)、高效地包覆(fu)和(he)遞送(song)核酸。從(cong)整體(ti)上(shang)理(li)解ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)特性(xing)(xing)也有助于設(she)計(ji)下一(yi)代(dai)ILs。這些(xie)性(xing)(xing)質(zhi)之一(yi)是(shi)計(ji)算出的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa（cpKa），可以很(hen)容易地在(zai)(zai)(zai)硅中確定(ding)。常見ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa值(zhi)在(zai)(zai)(zai)9到10.5之間（圖2）。最(zui)(zui)近(jin)(jin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)項研究表(biao)(biao)明，cpKa極度接近(jin)(jin)IL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)際pKa. ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa似乎(hu)影(ying)(ying)響相應(ying)LNP配方的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)整體(ti)pKa，這樣(yang)當IL 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa大約是(shi)8.5−10.5時，LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa值(zhi)約為6−7。IL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa和(he)LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)差值(zhi)似乎(hu)是(shi)固定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，約等于2 - 4個單位。因(yin)此(ci)，cpKa可以作為新ILs產品(pin)設(she)計(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)指導工具。ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)另外兩個不太被關注的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)(xing)質(zhi)是(shi)cLogP和(he)cLogD值(zhi)，它(ta)們分別代(dai)表(biao)(biao)分子(zi)在(zai)(zai)(zai)非電離(li)態和(he)電離(li)態下的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)親(qin)油性(xing)(xing)。在(zai)(zai)(zai)最(zui)(zui)近(jin)(jin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)項研究中，Rajappan等考(kao)察了pKa、cpKa和(he)cLogD對LNPs遞送(song)siRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)(ying)響，發(fa)(fa)現cLogD在(zai)(zai)(zai)10 - 14范圍內(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)效果最(zui)(zui)好。因(yin)為一(yi)些(xie)常見的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cLogP值(zhi)在(zai)(zai)(zai)15−20范圍內(nei) （圖2），在(zai)(zai)(zai)設(she)計(ji)下一(yi)代(dai)ILs時也應(ying)考(kao)慮其親(qin)油性(xing)(xing)性(xing)(xing)。由于電離(li)度（cpKa）和(he)親(qin)油性(xing)(xing)（cLogP） IL可以影(ying)(ying)響從(cong)最(zui)(zui)初的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)與(yu)核酸形(xing)成(cheng)復(fu)雜結構(gou)到最(zui)(zui)終納(na)米粒子(zi)形(xing)成(cheng)以及核酸遞送(song)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)整個流(liu)程，在(zai)(zai)(zai)合成(cheng)IL前同時考(kao)慮這兩個參數可能會極大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)推(tui)動(dong)高效IL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)(fa)現。不過(guo)，需要更(geng)多(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究來(lai)印證(zheng)這一(yi)觀點。

除了傳統的(de)CLs和(he)ILs外，還有一些(xie)兩(liang)(liang)性離(li)(li)子脂類的(de)例(li)子。在最近的(de)一項(xiang)研(yan)究中，Liu等人(ren)合成(cheng)(cheng)了一個(ge)名為iPhos的(de)超(chao)過500種兩(liang)(liang)性離(li)(li)子脂質的(de)庫。這些(xie)iPhos由一個(ge)胺(an)基、短疏水性尾部(bu)和(he)一個(ge)磷(lin)酸鹽連接體組成(cheng)(cheng)。研(yan)究認為，帶負(fu)電荷的(de)磷(lin)酸基促(cu)進了膜融合，并導致(zhi)核(he)內體釋(shi)放。最優的(de)9A1P9的(de)各種配方可(ke)以優先將目標核(he)酸輸送(song)到肝(gan)臟和(he)肺部(bu)。

綜上所述，ILs各部分的(de)(de)性質影響整體配方(fang)和生物學特性。過去50年(nian)間，為(wei)設計出理想的(de)(de)IL已(yi)經有了許多系統的(de)(de)研(yan)究。其(qi)中一些(xie)ILs已(yi)經被FDA批(pi)準用于基(ji)因(yin)制(zhi)劑的(de)(de)遞送。然而(er)，設計能夠在非肝靶上高效無毒地輸送不同(tong)類(lei)型的(de)(de)基(ji)因(yin)制(zhi)劑的(de)(de)ILs仍需大量(liang)研(yan)究。對ILs合成有更多興趣(qu)的(de)(de)讀者(zhe)可以參考一篇優秀(xiu)的(de)(de)相關綜述。

3.2固醇類(lei)

圖3 LNP配方中使用的固醇（綠色(se)(se)）、磷脂(zhi)（藍色(se)(se)）和PEG脂(zhi)質 （紅(hong)色(se)(se)）舉(ju)例

3.3磷脂類

磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)有助(zhu)于(yu)核酸(suan)的(de)(de)(de)(de)封裝和(he)LNPs穩定性(xing)的(de)(de)(de)(de)提高(gao)。與(yu)(yu)其他(ta)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)成(cheng)(cheng)分相(xiang)(xiang)比，它們的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)相(xiang)(xiang)對(dui)較(jiao)少(shao)，通常(chang)只占(zhan)配(pei)方中(zhong)(zhong)總脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)的(de)(de)(de)(de)10 - 20%。磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)因為可以自發(fa)地組(zu)織成(cheng)(cheng)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)雙分子層，并且具有較(jiao)高(gao)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)變(bian)溫度從而確(que)保(bao)LNPs的(de)(de)(de)(de)膜穩定性(xing)而被用(yong)(yong)作結(jie)(jie)構脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)。磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)位于(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)外圍(wei)，就像細胞(bao)膜一(yi)樣。這些(xie)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)通常(chang)是(shi)(shi)半合(he)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)，例如(ru)(ru)，磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿(jian)通常(chang)來自蛋黃和(he)大豆等(deng)天然來源(yuan)，可以通過化學(xue)修(xiu)飾使其包含脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪酸(suan)尾部(bu)。二(er)(er)硬脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿(jian) （DSPC）（見圖(tu)3）是(shi)(shi)一(yi)種臨床批(pi)準的(de)(de)(de)(de)LNPs結(jie)(jie)構脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)，用(yong)(yong)于(yu)如(ru)(ru)siRNA治療(liao)（Onpattro）和(he)針(zhen)對(dui)SARS-CoV-2的(de)(de)(de)(de)mRNA疫(yi)苗。DSPC在(zai)(zai)(zai)結(jie)(jie)構上由(you)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿(jian)頭(tou)基和(he)兩個飽和(he)18碳尾組(zu)成(cheng)(cheng)，形成(cheng)(cheng)一(yi)個緊密堆積的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)雙分子層。在(zai)(zai)(zai)LNPs中(zhong)(zhong)，它主要(yao)位于(yu)納(na)米(mi)顆(ke)粒(li)(li)表(biao)面，同時(shi)在(zai)(zai)(zai)納(na)米(mi)顆(ke)粒(li)(li)核中(zhong)(zhong)少(shao)量存在(zai)(zai)(zai)。二(er)(er)油(you)酰(xian)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)乙醇(chun)胺（DOPE）是(shi)(shi)另(ling)一(yi)種經常(chang)用(yong)(yong)于(yu)LNPs臨床前研(yan)究(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。由(you)于(yu)尾部(bu)不(bu)飽和(he)，DOPE不(bu)僅形成(cheng)(cheng)流動性(xing)更好的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)層，而且具有形成(cheng)(cheng)六邊(bian)形II （HII）相(xiang)(xiang)結(jie)(jie)構的(de)(de)(de)(de)內在(zai)(zai)(zai)能(neng)力。HII相(xiang)(xiang)結(jie)(jie)構被認為能(neng)促進脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)膜與(yu)(yu)核內體膜的(de)(de)(de)(de)膜融合(he)，進而使核酸(suan)制劑(ji)在(zai)(zai)(zai)胞(bao)質(zhi)(zhi)內釋放。多項研(yan)究(jiu)(jiu)表(biao)明，與(yu)(yu)DSPC相(xiang)(xiang)比，DOPE可以提高(gao)率(lv)(lv)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基LNPs中(zhong)(zhong)RNA的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)染效率(lv)(lv)。近期，Zhang等(deng)人報(bao)道稱，DOPE可導(dao)致(zhi)C12-200 LNPs在(zai)(zai)(zai)肝臟內的(de)(de)(de)(de)聚集，而DSPC會導(dao)致(zhi)靜脈給藥時(shi)脾積聚，證明了結(jie)(jie)構脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)對(dui)LNP生物(wu)分布的(de)(de)(de)(de)影響。我們還(huan)發(fa)現，用(yong)(yong)天然糖(tang)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)替代MC3基LNPs中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)DSPC會影響mRNA轉(zhuan)(zhuan)染，來自植物(wu)的(de)(de)(de)(de)膜脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)--高(gao)絲氨(an)酸(suan)（DGTS）（見圖(tu)3），可以根據給藥途徑(jing)表(biao)現出不(bu)同的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)染效率(lv)(lv)。總之，這些(xie)研(yan)究(jiu)(jiu)突(tu)出了結(jie)(jie)構脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)在(zai)(zai)(zai)LNPs介導(dao)的(de)(de)(de)(de)RNA遞送中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)性(xing)。

3.4嵌PEG脂質

嵌PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)（PEG-lipids，見圖3）是控制(zhi)(zhi)LNPs半衰期和細(xi)(xi)胞(bao)攝入的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)個重(zhong)要(yao)組成(cheng)部分。在(zai)LNP組裝過(guo)程中(zhong)，PEG鏈由(you)于(yu)其親水(shui)性(xing)和大(da)(da)體(ti)(ti)積而位于(yu)納米(mi)顆粒的(de)(de)(de)(de)(de)(de)外(wai)殼中(zhong)。與(yu)(yu)(yu)其他納米(mi)載(zai)體(ti)(ti)一(yi)樣，PEG為LNPs提供了外(wai)部聚(ju)合(he)物(wu)層，以阻礙血清蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)和單核(he)吞(tun)噬細(xi)(xi)胞(bao)系統的(de)(de)(de)(de)(de)(de)吸附，延長(chang)(chang)體(ti)(ti)內(nei)循環(huan)時(shi)(shi)間。PEG還(huan)可以防(fang)止(zhi)納米(mi)顆粒在(zai)儲存過(guo)程以及血液中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)聚(ju)集。此(ci)(ci)外(wai)，PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)可能(neng)決定顆粒的(de)(de)(de)(de)(de)(de)大(da)(da)小。PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)另一(yi)個潛在(zai)用(yong)(yong)(yong)途是功能(neng)化LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表面(mian)，使(shi)LNPs與(yu)(yu)(yu)配體(ti)(ti)或生(sheng)物(wu)大(da)(da)分子結(jie)合(he)成(cheng)為可能(neng)。例如，Singh等(deng)使(shi)用(yong)(yong)(yong)DSPE-PEG-胺通過(guo)NHS/EDC化學(xue)共軛結(jie)合(he)透明質(zhi)酸(suan)來(lai)(lai)靶(ba)向治療腫(zhong)瘤，Parhiz等(deng)使(shi)用(yong)(yong)(yong)DSPE-PEG-馬來(lai)(lai)酰亞(ya)胺通過(guo)SATA-馬來(lai)(lai)酰亞(ya)胺化學(xue)共軛結(jie)合(he)抗體(ti)(ti)。雖(sui)然(ran)PEG有(you)助于(yu)LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩定性(xing)和生(sheng)物(wu)偶聯，但其解吸對(dui)細(xi)(xi)胞(bao)轉染(ran)也(ye)至(zhi)關重(zhong)要(yao)。PEG從LNPs中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脫落可使(shi)血清蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)（如載(zai)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)和白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)）產生(sheng)調(diao)理作(zuo)用(yong)(yong)(yong)，這是LNPs發生(sheng)受(shou)體(ti)(ti)介導(dao)內(nei)吞(tun)作(zuo)用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)關鍵效應物(wu)。Akinc等(deng)人(ren)證明ApoE與(yu)(yu)(yu)LNPs結(jie)合(he)后，導(dao)致低密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)受(shou)體(ti)(ti)（LDLR）介導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)肝細(xi)(xi)胞(bao)內(nei)化。由(you)于(yu)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)抑(yi)制(zhi)(zhi)ApoE與(yu)(yu)(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)合(he)，過(guo)量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)PEG 脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)會對(dui)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)攝入和轉染(ran)產生(sheng)不利影響(xiang)(xiang)。含(han)有(you)較(jiao)少PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)LNPs由(you)于(yu)更(geng)容易與(yu)(yu)(yu)ApoE結(jie)合(he)表現出更(geng)高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)酸(suan)遞送效率。PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)錨(mao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)長(chang)(chang)度也(ye)是決定解吸速(su)(su)率的(de)(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)因素。Mui等(deng)報道(dao)了PEG從LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脫落與(yu)(yu)(yu)PEG-脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)錨(mao)定長(chang)(chang)度成(cheng)反比(bi)，這是因為PEG-脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)與(yu)(yu)(yu)LNP膜(mo)之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)疏水(shui)相互作(zuo)用(yong)(yong)(yong)隨著(zhu)PEG-脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)錨(mao)定長(chang)(chang)度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加而增加。Suzuki等(deng)提出，PEG脫落的(de)(de)(de)(de)(de)(de)速(su)(su)度也(ye)可能(neng)影響(xiang)(xiang)抗-PEG抗體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)產生(sheng)，并反復給藥(yao)會引(yin)起并發癥。靜(jing)脈給藥(yao)LNP配方中(zhong)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)很少超過(guo)2%；然(ran)而，密(mi)集的(de)(de)(de)(de)(de)(de)聚(ju)乙(yi)二醇層可能(neng)有(you)利于(yu)達(da)到(dao)肝外(wai)靶(ba)點。Lee等(deng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究結(jie)果顯示，相較(jiao)2.5%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)含(han)量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)，5%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)含(han)量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)時(shi)(shi)LNPs在(zai)腫(zhong)瘤中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)積累更(geng)量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)高于(yu)，Lokugamage等(deng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究表明，PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)對(dui)霧化LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)遞送至(zhi)關重(zhong)要(yao)。因此(ci)(ci)，LNPs中(zhong)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)和種類可能(neng)需要(yao)根據臨床需求謹慎調(diao)整。

4.性質

LNPs的(de)平均(jun)尺(chi)(chi)寸(cun)和(he)(he)尺(chi)(chi)寸(cun)分布(bu)是各(ge)種應用中(zhong)LNP質(zhi)量和(he)(he)適用性的(de)重要初(chu)始決定(ding)因素，這些性質(zhi)通(tong)常用動(dong)態光散射(she)（DLS）來(lai)研究。一(yi)般(ban)來(lai)說，LNP的(de)最(zui)佳(jia)尺(chi)(chi)寸(cun)為20 - 200nm，因為這個尺(chi)(chi)寸(cun)使其在(zai)流(liu)體（如(ru)血液和(he)(he)淋巴）中(zhong)足(zu)夠穩定(ding)，同時(shi)(shi)(shi)能(neng)夠穿過(guo)(guo)間隙。LNP的(de)尺(chi)(chi)寸(cun)通(tong)常通(tong)過(guo)(guo)改變PEG脂質(zhi)的(de)量或混合(he)參數（如(ru)流(liu)速和(he)(he)體積比(bi)）來(lai)調節。LNPs的(de)尺(chi)(chi)寸(cun)可能(neng)會影響(xiang)其內吞、生物(wu)(wu)分布(bu)、降解(jie)和(he)(he)清除(chu)，不同的(de)應用可能(neng)需要不同的(de)粒徑(jing)。例(li)如(ru)，45 nm的(de)siRNA LNPs在(zai)皮下給藥(yao)(yao)時(shi)(shi)(shi)最(zui)有(you)效，而(er)80 nm 的(de)siRNA LNPs在(zai)小鼠靜(jing)脈給藥(yao)(yao)時(shi)(shi)(shi)最(zui)有(you)效。然而(er)，對嚙齒動(dong)物(wu)(wu)和(he)(he)非人靈長(chang)類動(dong)物(wu)(wu)中(zhong)各(ge)種粒徑(jing)mRNA-LNP的(de)對比(bi)表明(ming)，非人靈長(chang)類動(dong)物(wu)(wu)肌肉注射(she)時(shi)(shi)(shi)對LNPs粒徑(jing)不太敏感。

LNP依靠表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)與細(xi)胞膜(mo)和(he)(he)(he)生(sheng)物(wu)環境(jing)進行相互(hu)(hu)作用。由于細(xi)胞膜(mo)帶(dai)負電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)，表(biao)面(mian)帶(dai)負電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)LNPs會(hui)被細(xi)胞膜(mo)排斥(chi)從而不(bu)(bu)被細(xi)胞吸收。另一方面(mian)，帶(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)LNPs可(ke)(ke)能會(hui)直接破(po)壞細(xi)胞膜(mo)，引起細(xi)胞毒性。這(zhe)就凸(tu)顯了可(ke)(ke)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)離(li)(li)(li)脂質(zhi)在(zai)(zai)(zai)(zai)LNP設計(ji)中(zhong)的(de)(de)(de)重要性：最(zui)初，含(han)(han)有可(ke)(ke)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)離(li)(li)(li)脂質(zhi)的(de)(de)(de)LNP是(shi)中(zhong)性的(de)(de)(de)，可(ke)(ke)以避免(mian)任何不(bu)(bu)必要的(de)(de)(de)靜電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)相互(hu)(hu)作用，但在(zai)(zai)(zai)(zai)酸(suan)性內體pH環境(jing)下(xia)會(hui)帶(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)。LNPs的(de)(de)(de)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)通常(chang)(chang)用zeta電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)位(wei)測量來(lai)評估(gu)，該(gai)技術通常(chang)(chang)用于評估(gu)膠體聚集，盡(jin)管沒有嚴格的(de)(de)(de)分類，但如(ru)果(guo)zeta電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)位(wei)落在(zai)(zai)(zai)(zai)-20和(he)(he)(he)+20 mV之(zhi)間，則(ze)認(ren)為(wei)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)較(jiao)弱。調整(zheng)LNPs總(zong)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)一種常(chang)(chang)見方法是(shi)調整(zheng)N/P比或者說電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)離(li)(li)(li)脂質(zhi)（N代表(biao)陽離(li)(li)(li)子胺）與核(he)酸(suan)（P代表(biao)陰(yin)離(li)(li)(li)子磷酸(suan)鹽）的(de)(de)(de)比值。Carrasco等認(ren)為(wei)，增加含(han)(han)有可(ke)(ke)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)離(li)(li)(li)脂質(zhi)KC2的(de)(de)(de)LNPs中(zhong)的(de)(de)(de)N/P比可(ke)(ke)以增加表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)和(he)(he)(he)封(feng)裝效(xiao)率。有趣的(de)(de)(de)是(shi)，在(zai)(zai)(zai)(zai)LNPs中(zhong)加入永久帶(dai)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)的(de)(de)(de)脂質(zhi)時可(ke)(ke)能在(zai)(zai)(zai)(zai)不(bu)(bu)增加表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)情(qing)況下(xia)改變優先攝取的(de)(de)(de)器官(guan)(guan)。Cheng等基于脂質(zhi)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)在(zai)(zai)(zai)(zai)小鼠中(zhong)實(shi)現(xian)了選擇性器官(guan)(guan)靶(ba)向(xiang)（SORT）：向(xiang)LNP配方中(zhong)添加帶(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)脂質(zhi)可(ke)(ke)實(shi)現(xian)肺組織的(de)(de)(de)優先轉染，而帶(dai)負電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)脂質(zhi)則(ze)將轉染導(dao)向(xiang)脾臟。

脂(zhi)(zhi)質(zhi)封包可(ke)(ke)(ke)能會影響從膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)水化和(he)變(bian)形(xing)(xing)能力到(dao)(dao)細胞攝(she)取和(he)核(he)酸(suan)釋(shi)放等許多參數。最近的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一篇綜述(shu)總結(jie)(jie)了(le)形(xing)(xing)成脂(zhi)(zhi)質(zhi)囊泡所(suo)需的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基礎知識(shi)。簡單地說，每(mei)種脂(zhi)(zhi)質(zhi)都可(ke)(ke)(ke)以用一個封包參數來描述(shu)，該參數取決于脂(zhi)(zhi)質(zhi)極性“頭(tou)”和(he)非極性“尾”所(suo)占的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)積(ji)。結(jie)(jie)構(gou)平衡的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)形(xing)(xing)成柱(zhu)狀結(jie)(jie)構(gou)和(he)層狀相，而“不(bu)平衡”結(jie)(jie)構(gou)則形(xing)(xing)成六(liu)(liu)(liu)方(fang)(fang)、立方(fang)(fang)和(he)膠束相。倒置的(de)(de)(de)(de)(de)(de)六(liu)(liu)(liu)方(fang)(fang)相（HII）表現(xian)出(chu)最顯著的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)膜(mo)(mo)融(rong)(rong)合促進作用。到(dao)(dao)目前為(wei)止，非層狀相的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)(ke)控制備在RNA-LNP遞送領域仍然(ran)(ran)是(shi)相對少見的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，納(na)米立方(fang)(fang)液晶是(shi)最突出(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)例子(zi)。然(ran)(ran)而，LNPs在暴露(lu)于環境誘因時(shi)可(ke)(ke)(ke)能發生(sheng)結(jie)(jie)構(gou)變(bian)化。Heyes等利(li)用核(he)磁共振波譜（P NMR）研(yan)究了(le)含(han)有(you)(you)一系列具(ju)有(you)(you)不(bu)同(tong)(tong)脂(zhi)(zhi)尾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)陽離(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)顆(ke)粒的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相變(bian)行為(wei)，發現(xian)層狀到(dao)(dao)倒置六(liu)(liu)(liu)方(fang)(fang)相轉變(bian)溫度（TBH）較低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)具(ju)有(you)(you)更(geng)好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)融(rong)(rong)合促進能力，這(zhe)一點(dian)在基因沉默效率(lv)上得(de)到(dao)(dao)了(le)證明。同(tong)(tong)樣，其(qi)中一個膜(mo)(mo)不(bu)穩定理(li)論提出(chu)，當可(ke)(ke)(ke)電(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)質(zhi)暴露(lu)于晚(wan)期核(he)內(nei)(nei)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)酸(suan)性pH時(shi)，可(ke)(ke)(ke)電(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)質(zhi)與核(he)內(nei)(nei)體(ti)(ti)膜(mo)(mo)內(nei)(nei)磷脂(zhi)(zhi)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靜電(dian)相互(hu)作用會導(dao)致(zhi)膜(mo)(mo)破裂(lie)。Liu等最近的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一項工(gong)作基于這(zhe)一概念，報(bao)道了(le)利(li)用核(he)磁共振波譜得(de)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一種新型可(ke)(ke)(ke)電(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)質(zhi)暴露(lu)于核(he)內(nei)(nei)體(ti)(ti)模擬物時(shi)倒置六(liu)(liu)(liu)方(fang)(fang)相形(xing)(xing)成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)證據。雖(sui)然(ran)(ran)pH誘導(dao)關聯是(shi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)材料最常見的(de)(de)(de)(de)(de)(de)機制，但在我(wo)們最近的(de)(de)(de)(de)(de)(de)綜述(shu)中討論了(le)其(qi)他導(dao)致(zhi)核(he)內(nei)(nei)體(ti)(ti)膜(mo)(mo)不(bu)穩定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)路(lu)徑。

由于脂(zhi)質相(xiang)和(he)整體(ti)極性(xing)的(de)(de)不同，脂(zhi)膜(mo)可(ke)能(neng)(neng)會捕獲水(shui)(shui)(shui)從而改(gai)變(bian)膜(mo)的(de)(de)流動性(xing)或變(bian)形(xing)性(xing)，這可(ke)能(neng)(neng)會影響(xiang)脂(zhi)膜(mo)融合。膜(mo)水(shui)(shui)(shui)合作(zuo)(zuo)用(yong)也可(ke)能(neng)(neng)影響(xiang)對pH的(de)(de)潛在響(xiang)應，而pH通(tong)常作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)啟動核酸(suan)釋放(fang)的(de)(de)一個(ge)(ge)重(zhong)要環境(jing)誘因(yin)。LNP在其生命周期中所涉及的(de)(de)pH波動如圖4所示。當LNPs進(jin)入細(xi)胞內空(kong)間(jian)時，它們(men)被束縛在核內體(ti)中，而核內體(ti)在成(cheng)熟為(wei)(wei)溶酶體(ti)時會逐漸酸(suan)化(hua)。因(yin)此(ci)，脂(zhi)質膜(mo)內較(jiao)高(gao)的(de)(de)含水(shui)(shui)(shui)量可(ke)能(neng)(neng)會影響(xiang)酸(suan)化(hua)動力(li)學，并有(you)加速(su)膜(mo)的(de)(de)失穩(wen)。Koitabashi等(deng)通(tong)過Laurdan實驗研究了siRNA-LNPs中pH值對脂(zhi)膜(mo)穩(wen)定性(xing)的(de)(de)影響(xiang)，發(fa)(fa)現(xian)膜(mo)水(shui)(shui)(shui)合作(zuo)(zuo)用(yong)與(yu)基因(yin)沉(chen)默效率呈正相(xiang)關；然而，該(gai)研究并未關注(zhu)酸(suan)化(hua)動力(li)學。關于膜(mo)水(shui)(shui)(shui)合有(you)一個(ge)(ge)有(you)意思的(de)(de)現(xian)象(xiang)，核磁共振波譜(pu)結(jie)果表明，siRNA-LNPs比相(xiang)同配(pei)方(fang)的(de)(de)mRNA-LNPs的(de)(de)含水(shui)(shui)(shui)量更(geng)少，這可(ke)能(neng)(neng)是(shi)因(yin)為(wei)(wei)親水(shui)(shui)(shui)RNA鏈的(de)(de)長(chang)度更(geng)長(chang)。Carrasco等(deng)進(jin)一步證(zheng)明了這些觀點，他們(men)發(fa)(fa)現(xian)低N/P比的(de)(de)KC2 LNPs單(dan)個(ge)(ge)納米顆粒(li)中包含更(geng)多的(de)(de)mRNA和(he)脂(zhi)質，并且(qie)有(you)較(jiao)高(gao)的(de)(de)介電常數，認為(wei)(wei)低N/P比的(de)(de)LNPs比高(gao)N/P比的(de)(de)LNPs更(geng)易水(shui)(shui)(shui)合。更(geng)高(gao)的(de)(de)RNA載量也會使轉(zhuan)染得到改(gai)善。因(yin)此(ci)，mRNA-LNPs可(ke)能(neng)(neng)對環境(jing)變(bian)化(hua)更(geng)敏(min)感(gan)，盡管pH敏(min)感(gan)性(xing)的(de)(de)變(bian)化(hua)可(ke)能(neng)(neng)與(yu)生物過程的(de)(de)時間(jian)尺度無關。暴(bao)露在生物環境(jing)中的(de)(de)重(zhong)組進(jin)一步使LNP殼(ke)水(shui)(shui)(shui)化(hua)的(de)(de)問題變(bian)得復雜。

圖4 LNP生命周期中涉及的pH變化

LNPs固(gu)有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)水環境也對(dui)其長(chang)期(qi)穩定構(gou)成威(wei)脅。純核(he)酸在環境條(tiao)件下(xia)可(ke)(ke)通過外(wai)源RNase降解(jie)或自水解(jie)迅(xun)速(su)(su)惡化。雖(sui)然LNPs可(ke)(ke)以保(bao)護核(he)酸免受酶降解(jie)，但(dan)它(ta)們容易因為(wei)熱力(li)學因素（如最小化相(xiang)分離）聚集，可(ke)(ke)能(neng)導致納米顆粒融合時核(he)酸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)丟失，最終影響轉染效率。低(di)溫保(bao)存(cun)(cun)和(he)凍干可(ke)(ke)以保(bao)護RNA，但(dan)是冰結(jie)晶會(hui)損傷(shang)LNPs，盡管(guan)加(jia)入蔗(zhe)糖等低(di)溫保(bao)護劑似乎可(ke)(ke)以緩解(jie)這個問題。有(you)(you)趣的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是，LNPs可(ke)(ke)能(neng)會(hui)根據儲(chu)存(cun)(cun)條(tiao)件改變優先攝取其的(de)(de)(de)(de)(de)(de)器官，這可(ke)(ke)能(neng)是它(ta)們重組的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果(guo)。從(cong)實踐的(de)(de)(de)(de)(de)(de)角度來(lai)看(kan)，最近開發的(de)(de)(de)(de)(de)(de)針(zhen)對(dui)COVID-19的(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA-LNP疫苗為(wei)RNA療法(fa)(fa)(fa)(fa)創建了物流基礎設施，這可(ke)(ke)能(neng)會(hui)消除(chu)關于(yu)LNP穩定性(xing)、存(cun)(cun)儲(chu)和(he)運輸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)許(xu)多(duo)擔憂。這些疫苗擁有(you)(you)在冷凍溫度（-20°C）下(xia)長(chang)達6個月的(de)(de)(de)(de)(de)(de)以及室溫下(xia)長(chang)達30天的(de)(de)(de)(de)(de)(de)長(chang)期(qi)穩定性(xing)，極大(da)地推動了這些突(tu)破(po)性(xing)治療的(de)(de)(de)(de)(de)(de)普及。值(zhi)得(de)注(zhu)意(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是，輝(hui)瑞/BioNTech和(he)Moderna疫苗有(you)(you)著(zhu)不同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)存(cun)(cun)儲(chu)要(yao)求，這表明LNP配方的(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化可(ke)(ke)能(neng)會(hui)顯著(zhu)改變其核(he)酸親(qin)和(he)力(li)和(he)LNP穩定性(xing)。由于(yu)目前還(huan)沒有(you)(you)建立(li)針(zhen)對(dui)這些非晶材料的(de)(de)(de)(de)(de)(de)加(jia)速(su)(su)穩定性(xing)測試的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方法(fa)(fa)(fa)(fa)，這意(yi)味著(zhu)，LNP穩定性(xing)只(zhi)能(neng)在離散時間點(dian)進行經(jing)驗評(ping)估，差(cha)示掃描量熱法(fa)(fa)(fa)(fa)（DSC）等方法(fa)(fa)(fa)(fa)可(ke)(ke)能(neng)對(dui)LNP退化提供有(you)(you)價(jia)值(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)參考。最后，預測基于(yu)LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)RNA療法(fa)(fa)(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)下(xia)游特性(xing)需要(yao)我們對(dui)LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)自組裝(zhuang)過程有(you)(you)更深的(de)(de)(de)(de)(de)(de)理解(jie)。

圖5 LNP結構(gou)待解(jie)決問題

5.結論和展(zhan)望

LNPs是(shi)一種(zhong)高(gao)度(du)可定制的(de)(de)(de)核(he)酸載體，在(zai)mRNA疫苗(miao)中顯示出巨大(da)的(de)(de)(de)潛力。我們(men)也(ye)不應忽視它們(men)在(zai)治療(liao)罕見疾病(bing)和(he)(he)癌癥方面的(de)(de)(de)可能(neng)價值。mRNA治療(liao)可以(yi)幫助產生治療(liao)性(xing)蛋白來恢復受損組織或器官的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)。全球開展了(le)大(da)量的(de)(de)(de)科學(xue)研(yan)究(jiu)來設計和(he)(he)細(xi)化LNPs的(de)(de)(de)單個(ge)成分，以(yi)便高(gao)效(xiao)和(he)(he)安全地遞(di)送所關(guan)注的(de)(de)(de)核(he)酸。然(ran)而(er)，LNP科學(xue)方興未艾(ai)，還(huan)有(you)許多(duo)懸而(er)未決的(de)(de)(de)問(wen)題(ti)，圖5中列出了(le)其中的(de)(de)(de)一些。毫無疑問(wen)，公眾對mRNA疫苗(miao)的(de)(de)(de)持續高(gao)漲的(de)(de)(de)興趣將激勵這一領域(yu)的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)工作，我們(men)謹(jin)慎樂觀地認(ren)為(wei)，我們(men)正(zheng)在(zai)見證(zheng)納米醫學(xue)的(de)(de)(de)新(xin)時代。

原文來源：Chemistry of Lipid Nanoparticles for RNA Delivery.Acc Chem Res. 2022 Jan 4;55(1):2-12.