Life Med|脂質(zhi)納(na)米顆粒靶向遞送mRNA研發(fa)策略

湃客：Life Medicine 2022-06-28 07:06

針對近幾年席卷全球的新型冠狀病毒（COVID-19），疫苗研發一直是布局重點和焦點，被寄予厚望。其中，BNT162b（商品名Comirnaty）和mRNA-1273（商品名Spikevax）兩款mRNA納米疫苗以其極高的保護效率和研發速度聞名于世，并迅速引發國內外廣泛關注。目前，以mRNA疫苗為研究熱點的核酸疫苗被視為是繼（減毒）滅活疫苗、亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗，正在引領疫苗研發的潮流，相關產業也正如火如荼的進行中。“新冠”mRNA疫苗的成功同時推動了全球范圍內mRNA的產業化進程。 這些事件的背后實際上是mRNA分子優化、體內遞送等底層相關技術取得的長足進展，特別是在脂質納米顆粒（LNPs）遞送平臺的突破。一般認為，LNPs是遞送mRNA最好的選擇之一，若要擴寬mRNA的應用場景，研發靶向遞送LNPs技術至關重要。

底層技術的發展加速mRNA應用

自20世(shi)紀(ji)60年代mRNA被發(fa)現以來，有關mRNA的應用探(tan)索就(jiu)一刻也不曾停止。mRNA分子具(ju)有不穩(wen)定性(xing)、免疫(yi)原(yuan)性(xing)、無法高效進入細(xi)胞等特(te)點(dian)，在實際(ji)應用中(zhong)非(fei)常受限(xian)。隨著mRNA分子優化(hua)技術、遞送技術平臺的不斷發(fa)展(zhan)，這些(xie)缺點(dian)正在慢(man)慢(man)地(di)被克服。

其(qi)一(yi)，mRNA分(fen)(fen)子優(you)化(hua)平(ping)臺(tai)，包括(kuo)有：1）序(xu)列(lie)優(you)化(hua)的(de)(de)進展，如5，3端非(fei)翻譯區序(xu)列(lie)的(de)(de)篩選、多聚腺嘌呤(ling)（poly A）尾巴的(de)(de)長度優(you)化(hua)、開放(fang)閱(yue)讀(du)框（ORF）密(mi)碼子的(de)(de)優(you)選等；2）核(he)苷(gan)酸化(hua)學修飾的(de)(de)引入，如5-甲(jia)基(ji)(ji)尿苷(gan)和N1-甲(jia)基(ji)(ji)假(jia)尿苷(gan)的(de)(de)使(shi)用(yong)不(bu)僅能(neng)(neng)(neng)降低mRNA的(de)(de)免(mian)疫原性(xing)，還能(neng)(neng)(neng)提高其(qi)穩定(ding)(ding)性(xing)；3）制(zhi)備(bei)工藝的(de)(de)提升(sheng)，如體外轉(zhuan)錄（IVT）放(fang)大工藝的(de)(de)成(cheng)(cheng)熟、加(jia)帽(mao)工序(xu)的(de)(de)簡化(hua)、純化(hua)和質檢方(fang)法(fa)的(de)(de)穩定(ding)(ding)等。其(qi)二，遞(di)送(song)載體平(ping)臺(tai)，尤(you)其(qi)是LNPs遞(di)送(song)技(ji)術的(de)(de)相對成(cheng)(cheng)熟。一(yi)般來講，LNPs由(you)四(si)種成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)組成(cheng)(cheng)，每(mei)種成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)都扮演著(zhu)相對重(zhong)要的(de)(de)角色：可電離陽離子脂質被認為是LNPs中(zhong)(zhong)最重(zhong)要的(de)(de)成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)，它直接決定(ding)(ding)了mRNA的(de)(de)包裹(guo)效(xiao)率(lv)和遞(di)送(song)效(xiao)率(lv)；中(zhong)(zhong)性(xing)輔助磷脂（如DSPC、DOPE）和膽固(gu)醇脂質有助于提升(sheng)LNPs的(de)(de)穩定(ding)(ding)性(xing)以(yi)及轉(zhuan)染效(xiao)率(lv)；聚乙二醇脂（PEG-Lipid）在(zai)調節LNPs尺寸、穩定(ding)(ding)性(xing)、半(ban)衰期、遞(di)送(song)效(xiao)率(lv)等方(fang)面的(de)(de)作用(yong)也十分(fen)(fen)明顯。值得(de)指出的(de)(de)是，LNPs中(zhong)(zhong)單一(yi)成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)并(bing)非(fei)獨自(zi)行使(shi)功能(neng)(neng)(neng)，各(ge)組分(fen)(fen)之間的(de)(de)配(pei)比在(zai)mRNA的(de)(de)實際應用(yong)中(zhong)(zhong)非(fei)常重(zhong)要。

通(tong)過多手段研(yan)(yan)發技術，目前(qian)LNPs-mRNA已被應用到多個領(ling)域，包括疫苗研(yan)(yan)發、針(zhen)對多種重大(da)疾病(bing)的(de)蛋(dan)白替代療(liao)(liao)法(fa)、基因編(bian)輯療(liao)(liao)法(fa)、細胞療(liao)(liao)法(fa)等方面(mian)。 

LNPs靶向遞送策(ce)略擴寬mRNA應(ying)用場景

mRNA精準遞(di)送是保證治療效果的(de)必要條件(jian)之一。針對體(ti)表的(de)組織器官（如(ru)肌肉、眼等）可通過局部給(gei)藥方式實(shi)現，而體(ti)內更(geng)深層次器官的(de)遞(di)送則(ze)選擇靜脈注射更(geng)為合適。靜脈給(gei)藥后LNPs介(jie)導的(de)肝臟靶向較容易實(shi)現，如(ru)何實(shi)現肝外(wai)的(de)選擇性遞(di)送則(ze)具有挑戰。針對此(ci)科學(xue)問題(ti)，研究人員嘗試了多(duo)種策略(lve)，取得了不(bu)錯進展(zhan)。本亮點文章重點總(zong)結了近期(qi)發表的(de)幾類(lei)mRNA靶向遞(di)送策略(lve)。

（一）靶向分(fen)子(zi)修(xiu)飾

在(zai)LNPs表面(mian)(mian)進行(xing)(xing)靶向(xiang)分子修(xiu)飾(shi)(shi)(shi)是實(shi)現(xian)細(xi)胞(bao)靶向(xiang)遞送(song)最(zui)直(zhi)接的(de)(de)方法。Jonathan A. Epstein教授團(tuan)隊最(zui)近(jin)利用(yong)CD5抗(kang)體(ti)修(xiu)飾(shi)(shi)(shi)包裹了(le)CAR mRNA的(de)(de)LNPs，可(ke)提高其體(ti)內(nei)靶向(xiang)T淋巴細(xi)胞(bao)的(de)(de)能力。將(jiang)上述mRNA制劑靜脈注(zhu)射到(dao)心(xin)衰(shuai)小鼠(shu)模型(xing)后，可(ke)在(zai)體(ti)內(nei)對T細(xi)胞(bao)進行(xing)(xing)重(zhong)編程，使其形成有(you)功能的(de)(de)CAR-T細(xi)胞(bao)，可(ke)以靶向(xiang)過度活躍(yue)的(de)(de)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)成纖維(wei)細(xi)胞(bao)，有(you)效降低(di)了(le)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)纖維(wei)化，并幫助小鼠(shu)恢復了(le)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)功能。Dan Peer教授團(tuan)隊通(tong)過重(zhong)組(zu)(zu)融合(he)蛋白(bai)(bai)（MadCAM-1-D1D2-Fc）修(xiu)飾(shi)(shi)(shi)LNPs技術(shu)，將(jiang)mRNA選擇(ze)性(xing)(xing)遞送(song)到(dao)特(te)定(ding)白(bai)(bai)細(xi)胞(bao)亞群，在(zai)結腸炎(yan)小鼠(shu)模型(xing)中展(zhan)現(xian)出了(le)潛在(zai)的(de)(de)治療前景。不同于抗(kang)體(ti)修(xiu)飾(shi)(shi)(shi)，Gabriel A. Kwong課題(ti)組(zu)(zu)最(zui)近(jin)開發了(le)一種光控的(de)(de)多肽(tai)配(pei)體(ti)置(zhi)換平臺，可(ke)快速(su)變(bian)換修(xiu)飾(shi)(shi)(shi)到(dao)LNPs表面(mian)(mian)的(de)(de)靶向(xiang)抗(kang)原(yuan)多肽(tai)，在(zai)體(ti)內(nei)實(shi)現(xian)對多種抗(kang)原(yuan)特(te)異性(xing)(xing)T細(xi)胞(bao)群的(de)(de)靶向(xiang)mRNA遞送(song)。以上修(xiu)飾(shi)(shi)(shi)技術(shu)可(ke)顯著增強對特(te)定(ding)細(xi)胞(bao)類型(xing)的(de)(de)靶向(xiang)遞送(song)能力，但在(zai)特(te)異性(xing)(xing)方面(mian)(mian)略顯不足。

（二）高通(tong)量篩(shai)選

上文提(ti)到，可(ke)(ke)離(li)子化陽(yang)離(li)子脂質是LNPs中(zhong)最(zui)重要的成(cheng)分(fen)。通過結(jie)構各(ge)異的化學結(jie)構庫進行高通量(liang)篩(shai)選(xuan)早已被證實(shi)是研(yan)發靶(ba)向LNPs最(zui)為有效(xiao)的方(fang)(fang)法之一，目(mu)前大多(duo)數LNPs是由此技(ji)(ji)術(shu)研(yan)發產生的，可(ke)(ke)實(shi)現肝、肺、脾、腦(nao)等器官的mRNA遞送,但此方(fang)(fang)法相(xiang)對盲目(mu)、工作量(liang)大。James Dahlman課題(ti)組結(jie)合“DNA條形碼”和(he)深(shen)度(du)測(ce)序技(ji)(ji)術(shu)，開發了一種(zhong)新型(xing)的高通量(liang)篩(shai)選(xuan)技(ji)(ji)術(shu)，簡稱為FIND，可(ke)(ke)顯(xian)著提(ti)升LNPs的篩(shai)選(xuan)效(xiao)率。他(ta)們將(jiang)Cre mRNA和(he)特(te)(te)定序列(lie)的DNA條形碼包裹到同(tong)一個LNPs中(zhong)，只需設(she)計不同(tong)的DNA條形碼就可(ke)(ke)制備出帶有特(te)(te)定“標簽(qian)”的一系列(lie)LNPs-mRNA藥(yao)物。將(jiang)這些(xie)“標簽(qian)”各(ge)異的LNPs通過靜脈一起注射到Cre誘導表達tdTom的轉基因小鼠中(zhong)，利用(yong)流式(shi)細(xi)胞儀檢(jian)測(ce)tdTom陽(yang)性細(xi)胞，并結(jie)合DNA深(shen)度(du)測(ce)序的方(fang)(fang)法可(ke)(ke)鑒(jian)別出特(te)(te)定細(xi)胞靶(ba)向的LNPs載(zai)體。通過該體系，他(ta)們可(ke)(ke)同(tong)步(bu)篩(shai)選(xuan)超200種(zhong)LNPs，顯(xian)著提(ti)高了LNPs的篩(shai)選(xuan)效(xiao)率。

（三）可預(yu)測性LNPs優化

區別于高通量篩選，如果給出明確的LNPs設計原則，則會大大縮短研發周期，提高研發效率。Daniel Siegwart課題組2020年在Nature Nanotechnology上報道了一種可預測性設計的LNPs研發技術，命名為SORT。在原有4組分LNPs基礎上，僅添加一種帶有不同電荷的新脂質分子（SORT分子），則可實現mRNA在小鼠的肝臟、脾臟、肺部的靶向遞送和基因編輯。通過增加陽離子脂質能夠使mRNA特異遞送進入肺部；陰離子脂質能夠使mRNA特異進入脾臟；而可離子化陽離子脂質則會增強肝臟的靶向遞送。重要的是，SORT技術具有普適性，可在多種類型的LNPs基礎上快速研發出肝外器官靶向LNPs。進一步機制探究發現，SORT分子可調控SORT-LNPs在器官水平的生物分布、LNPs自身pka、及表面血清蛋白冠等，這些因素最終決定了LNPs在體內的靶向遞送能力。文中指出，在器官靶向遞送方面，LNPs表面的血清蛋白冠起到最關鍵作用，識別這些獨特的蛋白質可能會在未來研發靶向其他器官的LNPs方面有所幫助。

圖(tu)1. 體內靶(ba)向遞送mRNA-LNPs的研(yan)發策略。

總結與展望
器(qi)官選擇性遞送(song)對于(yu)(yu)拓寬mRNA臨床(chuang)應(ying)用至關重要(yao)。本文提到(dao)的(de)幾種代表性策(ce)略(lve)在一定(ding)程度上提出(chu)了解(jie)決方案，但(dan)各有不足之(zhi)處。如何(he)開發出(chu)靶向其(qi)他重要(yao)器(qi)官（如心臟(zang)、胰腺(xian)、腎(shen)臟(zang)）的(de)LNPs、如何(he)實現對特定(ding)臟(zang)器(qi)中(zhong)特定(ding)細胞(bao)類型的(de)靶向遞送(song)都是未來(lai)需要(yao)解(jie)決的(de)重要(yao)問題。隨著研究人(ren)員對mRNA靶向遞送(song)技術的(de)深(shen)入研究，相信(xin)未來(lai)會有更多的(de)靶向遞送(song)策(ce)略(lve)研發出(chu)來(lai)用于(yu)(yu)精準醫療研究。

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原文鏈(lian)接(jie)：//doi.org/10.1093/lifemedi/lnac004